Page 139 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 刘金容等: 灰树花菌丝体不同培养时期代谢组学分析 １ ３ ３ ９

两种灰树花子实体进行 ＣＥ￣ＭＳ 代谢组学分析ꎬ揭 生物工程( 上海) 股份有限公司完成ꎬ将测序的结
示了两种培养基中子实体初级代谢物的变化情 果在 ＮＣＢＩ 上比对 ＤＮＡ 序列ꎬ根据输出的比对结
况ꎻ雷露等(２０２０) 运用 ＵＰＬＣ￣ＱＴＯＦ￣ＭＳ 结合多变 果ꎬ初步确定供试菌株所属的物种ꎬ排除样品污
量统计分析的方法ꎬ探讨了添加天麻苦荞复配液 染ꎮ 在 ＮＣＢＩ 数据库中选择灰树花及同属不同种
对灰树花菌体代谢产物的差异ꎬ并发现添加天麻 的序列ꎬ用 ＭＥＧＡ １１ 中的 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 程序进行多序
苦荞复配液有助于增加灰树花胞外多糖产量和提 列比对ꎬ用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ 方法构建系统发育树ꎮ
升发酵液的营养价值与功能特性ꎮ 本研究以培养 １.３.３ 代谢组学分析 样品制备、提取物分析、代
１０、２０、３０ ｄ 的灰树花菌丝体为研究对象ꎬ采用非 谢物的鉴定、定量分析和生物信息学分析ꎬ均由生
靶向代谢组学( ＨＰＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ) 分析方法ꎬ研究灰 工生物工程( 上海) 股份有限公司( 网址:ｈｔｔｐｓ: / /
树花菌丝体不同生长阶段的代谢产物ꎬ探讨灰树 ｗｗｗ.ｓａｎｇｏｎ.ｃｏｍ / )严格按照标准程序进行操作ꎮ
花菌丝体不同生长阶段代谢物变化情况ꎬ以期为 供试样品的制备:参考周嫒婷等(２０２３) 和何
灰树花菌丝体代谢产物的开发和生产提供理论 亚琼等(２０２０) 的方法ꎬ从第 １０ 天开始每隔 １０ ｄ
参考ꎮ 取样 １ 次直至培养到 ３０ ｄꎬ每次取 ３ 个生物学重
复ꎮ 分别称取适量样品于 ２ ｍＬ 离心管中ꎬ加入钢
１ 材料与方法 珠ꎻ加入 １ ０００ μＬ ５０％甲醇水(４ ℃ 保存)ꎬ充分混
匀后置于 ２ ｍＬ 适配器里ꎬ浸入液氮充分研磨至粉
１.１ 供试菌株 末 状ꎻ将 样 品 置 于 ４ ℃ ꎬ１２ ０００ ｒ ｍｉｎ 离 心 １０
￣１
子实体采自广西姑婆山自然保护区壳斗科植 ｍｉｎꎻ吸取上清液ꎬ浓缩干燥ꎬ准确加入 ３００ μＬ ５０％
物林下(图 １)ꎬ分离纯化后得到菌株ꎬ再将测试的 ２￣氯￣Ｌ￣苯丙氨酸(４ ｍｇｍｇ ) 溶液复溶样品ꎬ取
￣１
灰树花菌株接种于 ＰＤＡ 培养基培养 １５ ｄꎬ进行菌 上清液过 ０.２２ μｍ 膜进行过滤ꎬ得供试样品ꎮ
株的活化ꎮ 液相 色 谱 条 件: 色 谱 柱 为 ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ®
１.２ 培养基配方 ＨＳＳ Ｔ３ ( ２. １ ｍｍ × １５０ ｍｍꎬ １. ８ μｍ) ( Ｗａｔｅｒｓꎬ
￣１ ￣１
ＧＰＣ 固体培养基(ｇＬ )配方:２０ ｇ 葡萄糖ꎬ６ ＭｉｌｆｏｒｄꎬＭＡꎬＵＳＡ)ꎻ色谱条件:０.２５ ｍＬｍｉｎ 流速ꎬ
ｇ 蛋白胨ꎬ１０ ｇ 玉米浆ꎬ１５ ｇ 琼脂ꎬ０.５ ｇ 硫酸镁ꎬ蒸 ４０ ℃柱温ꎬ进样量 ２ μＬꎮ 正离子模式ꎬ流动相为
馏水 １ ０００ ｍＬꎮ 培养基于锥形瓶中搅拌均匀ꎬ高 ０.１％甲酸乙腈(Ｂ )和 ０.１％甲酸水(Ａ )ꎬ负离子模
２
２
￣１
温灭菌ꎬ备用ꎮ 式ꎬ流动相为乙腈 ( Ｂ ) 和 ５ ｍｍｏｌ Ｌ 甲酸铵水
３
１.３ 方法 (Ａ )ꎮ 梯度洗脱程序:０ ~ １.０ ｍｉｎꎬ２％ Ｂꎻ１.０ ~ ９.０
３
１.３.１ 培养基的制备 采用平板培养法ꎬ配制的培 ｍｉｎ 由 ２％Ｂ 升至 ５０％Ｂꎻ９.０ ~ １２.０ ｍｉｎꎬ由 ５０％Ｂ 升
养基均为同一批次药品、试剂以及相同的培养基 至 ９８％Ｂꎻ１２.０ ~ １３.５ ｍｉｎꎬ保持 ９８％ Ｂꎻ１３.５ ~ １４.０
配方且为同一批次分装ꎬ每组设置 ３ 个重复ꎮ 用 ｍｉｎꎬ由 ９８％Ｂ 降至 ２％Ｂꎻ１４.０~２０.０ ｍｉｎꎬ保持 ２％Ｂꎮ
直径 １ ｃｍ 的打孔器打孔取同一来源的菌丝块接至 质谱 条 件: Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ １２０ 质 谱 检 测 器
ＧＰＣ 培养基ꎬ３ 个重复于同一培养环境下( 同一温 (Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ ＵＳＡ)ꎬ 电 喷 雾 离 子 源
度、湿度等) 培养ꎬ确保用于测试的菌株除培养时 (ＥＳＩ)ꎬ用正负离子模式分别采集数据ꎮ 正离子喷

间不同外ꎬ其余培养条件保持一致ꎮ 雾电压为 ３.５０ ｋＶꎬ负离子喷雾电压为－ ２.５０ ｋＶꎬ
１.３.２ 菌丝体鉴定 分别夹取培养 １０、２０、３０ ｄ 培 鞘气 ３０ ａｒｂꎬ辅助气 １０ ａｒｂꎮ 毛细管温度 ３２５ ℃ ꎬ
养基内部干净的灰树花菌丝体ꎬ放入 １.５ ｍＬ 的离 以分辨率 ７０ ０００ 进行一级全扫描ꎬ一级离子扫描
心管中ꎬ按照植物基因组 ＤＮＡ 快速 提 取 试 剂 盒 范围 １００ ~ １ ０００ ｍ / ｚꎬ并采用 ＨＣＤ 进行二级裂解ꎬ
(康维世纪生物科技股份有限公司ꎬＣＷ０５３１Ｍꎬ江 碰撞能量为 ３０ ｅＶꎬ二级分辨率为 １７ ５００ꎬ采集信
苏)的说明书进行操作ꎬ完成 ＤＮＡ 提取ꎮ ＰＣＲ 扩 号前 ８ 的离子进行碎裂ꎬ同时采用动态排除法去
增 ＩＴＳ 片段( ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５)ꎬＰＣＲ 程序:９４ ~ ９５ ℃ 预 除无必要的 ＭＳ / ＭＳ 信息(Ｔｒｙｇｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２)ꎮ

变性 ４ ~ ５ ｍｉｎꎻ９４ ~ ９５ ℃ 变性 ４０ ~ ６０ ｓꎬ５２ ~ ５４ ℃ １.４ 数据分析
退火 ４０ ~ ６０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 １.０ ~ １.５ ｍｉｎꎬ３３ ~ ３５ 个 运用 Ｐｒｏｔｅｏｗｉｚａｒｄ 软件包将原始质谱下机文件
循环ꎻ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎬ１５ ℃ 保存ꎮ 测序由生工 转换为 ｍｚＸＭＬ 文件格式ꎬ利用 Ｒ 软件进行峰检