Page 18 - 《广西植物》2025年第2期

２ ２ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
的浓度 (ｍｇｍＬ )ꎻ Ｖ 和 Ｖ 为样品液和解吸液的 制率ꎬ阳性对照为 ５￣氟尿嘧啶ꎮ
￣１
１ ２
体积 (ｍＬ)ꎮ Ａ 对照组 －Ａ 实验组
(
细胞增殖抑制率 ％ ) ＝ ×１００ꎮ
１.２.５.２ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 纯化桑树桑黄总三萜 将 Ａ 对照组 －Ａ 空白组
上述初步纯化的三萜粗提物减压浓缩ꎬ冷冻干燥ꎬ 式中: Ａ 为阳性对照的吸光度ꎻ Ａ 为实
对照组 实验组
取 １０ ｍｇ 三萜粗提物溶于 １ ｍＬ 甲醇中ꎬ用滤膜过 验样品的吸光度ꎻ Ａ 空白组 为不加样品的空白组吸
滤(０.２２ μｍ)ꎬ上样ꎬ经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 凝胶柱(１０ 光度ꎮ
ｍｍ × ６００ ｍｍ) 进一步纯化ꎬ分别使用 ３０％、６０％ １.２.８ 桑树桑黄总三萜抗氧化活性测定
甲醇各 ２５０ ｍＬ 先后洗脱ꎬ流速为 １ ｍＬｍｉｎ ꎬ每 １.２.８.１ ＤＰＰＨ 自由基清除率的测定 参照刘坤等
￣１
１０ ｍＬ 收集一管ꎬ每个梯度收集 ２５ 管ꎬ收集完成后 (２０１８)的方法ꎬ将 １００ μＬ ＤＰＰＨ 自由基溶液(６０
用高氯酸－冰醋酸显色法(李英迪等ꎬ２０２１) 做出洗 μｍｏｌＬ )与 １００ μＬ 不同浓度的样品溶液混合ꎬ
￣１
脱曲线ꎬ合并洗脱峰ꎮ 室温避光孵育 ３０ ｍｉｎꎬ５１７ ｎｍ 处测定吸光度( Ａ)ꎬ
１.２.６ 总三萜成分的检测 将纯化后的三萜粉末 ３ ＶＣ 作为阳性对照ꎮ 对照组和处理组都重复 ３ 次ꎮ
ｍｇ 溶解到 ３ ｍＬ 甲醇溶液中ꎬ涡旋振荡 １ ｍｉｎꎬ经 Ａ 对照组 －Ａ 样品
(
清除率 ％ ) ＝ ×１００ꎮ
０.２２ μｍ 滤膜过滤ꎬ即得检测溶液ꎮ Ａ
对照组
® 为样品反
液相条件:色谱柱为 Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ 式中: Ａ 对照组 为对照的吸光度ꎻ Ａ 样品
ＨＳＳ Ｔ３(２.１ ｍｍ × １５０ ｍｍꎬ１.８ μｍ)ꎮ 正离子模式ꎬ 应液(处理组)的吸光度ꎮ
流动相为 ０.１％甲酸水(Ａ)和 ０.１％甲酸乙腈(Ｂ)ꎬ梯 １.２.８.２ ＡＢＴＳ 自由基清除率的测定 参照刘坤等
度洗脱:０~１ ｍｉｎꎬ２％ Ｂꎻ１ ~ ９ ｍｉｎꎬ２％→５０％ Ｂꎻ９ ~ (２０１７)的方法ꎮ ２００ μＬ 反应体系中加入 １５０ μＬ
１２ ｍｉｎꎬ５０％→９８％ Ｂꎻ１２ ~ １３.５ ｍｉｎꎬ９８％ Ｂꎻ１３.５ ~ ＡＢＴＳ 反应液和 ５０ μＬ 不同浓度的样品ꎬ用酶标仪
１４ ｍｉｎꎬ９８％→２％ Ｂꎻ１４ ~ ２０ ｍｉｎꎬ２％ Ｂꎮ 负离子模 测定 ７３４ ｎｍ 的吸光度(Ａ)ꎬＶＣ 为阳性对照ꎮ 对照
￣１ 组和处理组都重复 ３ 次ꎮ 自由基清除率的计算公
式ꎬ流动相为 ５ ｍｍｏｌＬ 甲酸铵水(Ａ)和乙腈(Ｂ)ꎬ
洗脱梯度与正离子模式相同ꎻ流速为 ０. ２５ ｍＬ 式与 ＤＰＰＨ 法一致ꎮ
￣１
ｍｉｎ ꎻ柱温为 ４０ ℃ꎻ进样体积为 ２ μＬꎮ １.２.９ 数据处理 数据使用 Ｐｒｉｓｍ ９ 软件作图ꎬ并
质谱 条 件:Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ １２０ 质 谱 使用 ＳＰＳＳ ２２.０ 和 Ｄｅｓｉｇｎ￣Ｅｘｐｅｒｔ １３ 进行数据分析ꎮ
检测器( Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬＵＳＡ)ꎬ电喷雾离
２ 结果与分析
子源(ＥＳＩ)ꎬ正负离子模式ꎮ 喷雾电压为 ３.５０ ｋＶ
( ＋)和 － ２. ５０ ｋＶ( －)ꎻ检测质量扫描范 围 为 ｍ / ｚ
１００ ~ １ ０００ꎻ鞘气和辅助气的体积流量分别为 ３０ ２.１ 单因素结果
ａｒｂ 和 １０ ａｒｂꎻ毛细管温度为 ３２５ ℃ ꎻＭＳ 分辨率为 提取时间、乙醇浓度、提取温度、液料比对总
６０ ０００ꎬＭＳ / ＭＳ 分辨率为 １５ ０００ꎮ 三萜含量的影响见图 １ꎮ 由图 １ 可知ꎬ四因素均出
根据精确分子量进行代谢物的鉴定( 分子量 现了三萜提取量先升后降的趋势ꎮ 固定条件为乙
误差 ≤ ５ × １０ )ꎬ 后 续 根 据 ＭＳ / ＭＳ 碎 片 模 式 对 醇浓度 ８５％、提取温度 ３５ ℃ 、液料比 ２５ ∶ １( ｍＬ
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ｍｚＣｌｏｕｎｄ(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｍｚｃｌｏｕｄ.ｏｒｇ)以及标准品数 ｇ )时ꎬ提取时间 ５５ ｍｉｎ 时ꎬ总三萜含量最高( 图
￣１
据库等对比推测并筛选出三萜代谢物ꎮ １:Ａ)ꎻ固定条件为提取温度 ３５ ℃ 、液料比 ２５ ∶ １
１.２.７ 桑树桑黄总三萜抗肿瘤活性 参照 Ｌｉｕ 等 (ｍＬｇ )、提取时间 ５５ ｍｉｎ 时ꎬ乙醇浓度为 ７５％
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(２０１７) 的方法( ＣＣＫ８ 法)ꎬ研究桑树桑黄总三萜 时ꎬ总三萜含量最高(图 １:Ｂ)ꎻ固定条件为液料比
对癌细胞 ＨＣＴ￣１１６、ＳＧＣ７９０１ 和 ＰＣ３ 增殖的抑制 ２５ ∶ １(ｍＬｇ )、提取时间 ５５ ｍｉｎ、乙醇浓度 ７５％
￣１
作用ꎮ 将浓度为每毫升 ５×１０ 个的对数生长期的 时ꎬ提取温度 ４５ ℃ 时ꎬ总三萜含量最高(图 １:Ｃ)ꎻ
４
癌细胞加入 ９６ 孔板ꎬ每孔 １００ μＬꎬ培养箱中孵育 固定条件为提取时间 ５５ ｍｉｎ、乙醇浓度 ７５％、提取
２４ ｈꎮ 将不同浓度样品 １００ μＬ 加入各孔中ꎬ培养 温度 ３５ ℃ 时ꎬ液料比 ３５ ∶ １( ｍＬｇ ) 时ꎬ总三萜
￣１
２４ ｈꎻ吸出各孔培养基ꎬ加入含 １０％ ＣＣＫ８ 的 ＰＢＳ 含量最高( 图 １:Ｄ)ꎮ 综合考虑ꎬ最终选择提取时
溶液 １００ μＬꎬ继续培养 ２ ｈ 后ꎬ检测 ４５０ ｎｍ 的吸光 间 ５５ ｍｉｎ、乙醇浓度 ７５％、提取温度 ４５ ℃ 和液料
度(Ａ)ꎮ 根据以下公式计算样品对各个细胞的抑 比 ３５ ∶ １(ｍＬｇ )为最佳单因素条件ꎮ
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