Page 117 - 《广西植物》2022年第9期

ँ 期 谢 宇 峰 等 ᧥ 寡聚核苷酸介导的基因突变技术创制抗除草剂烟草新种质
ఋᢃʢɯ变为 ᧧᤟ᔀ 以及第 ᤃ԰Ꭾ 位氨基酸由 ୩ᔀʢ 变为 ᧧᤟ᔀᖔ
获得除草剂抗性水稻ᤥ 与应用广泛的成簇规律间
隔短回文重复序列及相关蛋白 ऊᑕ༁ྉ ऊ኏᧧୩۪኏ ᣰ ऊᑕ༁ɯ
技术ᖔ以及转录激活样效应因子核酸酶ྉఋዶᓂጶશɯ
技术ྉ ᧧༁ၤᔽႿᆍ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔϟँऐᎮଫ ᥘᔽዹၤႿᆍ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡ԰ԡɯ 相
比ᖔᨃᥘᥘ 技术所诱导的突变几乎都是有目的定点
突变ᖔ不会向生物体内引入新的基因ᤥ ାʢᔀᢃᔀʢ 等
ྉ԰ԡԡँɯ认为通过 ᨃᥘᥘ 技术诱导产生的生物不应
当归类于转基因生物ᤥ 在对转基因生物安全性争
论不休的今天ᖔᨃᥘᥘ 技术为生物品质的改良提供
了一条新的途径ᤥ 本研究以烟草品种ጸ᣽ሕ԰ᤃᆥ为材
料ᖔ利用同源克隆法获得 ዛᒦ୒ 基因ᖔ根据基因保守
区结构分析构建 ኏શዶ ᣰ ᧕શዶ 嵌合体分子ᖔ并利用该
嵌合体实现对 ዛᒦ୒ 基因的定点突变ᖔ创制对磺酰
脲类除草剂具有抗性的烟草新种质ᤥ
ϟজ 材料与方法
ϓॹϓ 材料和试剂
烟草ྉટᔠዞᅳᡙᔠᐹႥᐹ ᡙᐹᤇᐹዞࣩቂɯ 品种ጸ ᣽ሕ԰ᤃᆥ 由贵州
大学农业生物工程研究院山地植物资源保护与种
质创新省部共建教育部重点实验室保存并提供ᤥ
᧕ᓂ ԰ ԡԡԡ ᧕શዶ ቝᑕʢҴᔀʢܦᓂዶ ఋᑕी औᔽᡷၤ ᥈ऊ ାࣼ஦஦ᔀʢܦ᧕શዶ
快速纯化回收试剂盒购自 ఋᑕ᣽ᑕ኏ᑕ 宝生物工程ྉ 大
连ɯ 有限公司ଫᥘ୩ 培养基购自 ۪ၤᢃᡷᆍ ఋᔀዹၤႿᆍ᤟ᆍ੫ᢃ
ఋᥘ
ᓂᑕᤦᆍʢᑕᡷᆍᔽᔀ༁ 公司ଫ新型植物 ᧕શዶ 提取试剂盒购自
ఋ᧧ዶશ᥈ጶશ ା᧧ᨃఋጶऊ̀ 公司ଫ胶回收试剂盒ܦᡱ᥈ጶᥘ᥋ఋ
ጶᑕ༁ᢃ ჆ᔀዹᡷᆍʢ ୩ᢃ༁ᡷᔀቝ 购自 ۪ʢᆍቝᔀ੫ᑕ 公司ଫ氯磺隆购自
୩ᔽ੫ቝᑕ᥋ዶ᤟ʛʢᔽዹၤ 公司ଫ኏શዶ ᣰ ᧕શዶ 嵌合体由 ఋᑕ᣽ᑕ኏ᑕ
公司合成ଫ基因克隆引物由上海英骏生物技术有
限公司完成ᤥ
ϓॹԣ 方法
ϟ঎԰঎ϟ 烟草品种ጝ ᣽ሕ԰ᤃᆋ 基因组提取及 ዛᒦ୒ 基因克
隆জ 以烟草品 种 ጸ᣽ሕ԰ᤃ ᆥ 的叶片为材料ᖔ 使用
ఋ᧧ዶશ᥈ጶશ ା᧧ᨃఋጶऊ̀ 公司新型植物 ᧕શዶ 提取试剂
盒提取烟草基因组 ᧕શዶᤥ 根据 શऊା᧧ 报道的普通烟
草 ዛᒦ୒ 基因ྉ基因登录号᧥ᣮԡᎮᤃ࿗࿗঎ϟ 和 ᣮԡᎮᤃ࿗ጢ঎ϟɯ序
列设计同源克隆引物及含 ጢऐऐ 位点和 ϟᎮϟँ 位点突
变区扩增引物ᖔ引物序列如表 ϟ 所示ᤥ
参照 ఋᑕ᣽ᑕ኏ᑕ 公司 ᓂዶ ఋᑕी औᔽᡷၤ ᥈ऊ ାࣼ஦஦ᔀʢ 试剂
盒操作方法ᖔ对 ዛᒦ୒ 基因进行扩增ᤥ 扩增体系ྉጢԡ
᥋ϟ
ဂᓂɯ᧥ԡ঎ጢ ဂᓂ ఋᑕ᣽ᑕ኏ᑕ ᒦዛ ఋᑕीྉጢ Вኼဂᓂ ɯᖔ԰ጢ঎ԡ ဂᓂ
԰ ġ ᥈ऊ ାࣼ஦஦ᔀʢ֒ᖔऐ঎ԡ ဂᓂ ʛશఋ۪ ᥘᔽ଴ᡷࣼʢᔀྉ԰঎ጢ ቝቝᆍ᤟ኼ
ϟ ጢ ጢ ሕ
表 ϓই 烟草 ዛᒦ୒ 基因的克隆及保守区扩增引物
ఋᑕᤦ᤟ᔀ ϟজ ऊ᤟ᆍႿᔽႿ੫ ᑕႿʛ ዹᆍႿ༁ᔀʢ׹ᔀʛ ʢᔀ੫ᔽᆍႿ ᑕቝᡱ᤟ᔽ஦ᔽዹᑕᡷᔽᆍႿ
ᡱʢᔽቝᔀʢ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ༁ ᆍ஦ ᡷᆍᤦᑕዹዹᆍ ዛᒦ୒ ੫ᔀႿᔀ
引物 引物序列
۪ʢᔽቝᔀʢ ۪ʢᔽቝᔀʢ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ
୩ࣼ኏ዶ è ጢࣕ᥋ዶఋ᥈᥈ऊ᥈᥈ऊ᥈᥈ऊ᥈᥈ऊఋऊऊዶఋऊఋऊऊऊఋऊఋఋऊ᥋ሕࣕ
୩ࣼ኏ዶ ኏ ጢࣕ᥋ఋऊዶዶఋዶ᥈᥈ዶዶऊఋఋऊఋऊऊऊ᥈ఋऊ᥋ሕࣕ
୩ࣼ኏ା è ጢࣕ᥋ዶఋ᥈᥈ऊ᥈᥈ऊ᥈᥈ऊఋ᥈ऊ᥈᥈ऊ᥈᥈ऊఋऊऊዶఋऊఋऊऊऊ᥋ሕࣕ
୩ࣼ኏ା ኏ ጢࣕ᥋ఋऊዶዶఋዶ᥈᥈ዶዶऊఋఋऊఋऊऊऊ᥈ఋऊ᥋ሕࣕ
ጢऐऐ è ጢࣕ᥋᥈᥈᥈ऊ᥈᥈ఋ᥈ఋऊఋఋऊ᥈ऊऊ᥈ऊఋ᥈᥋ሕࣕ
ጢऐऐ ኏ ጢࣕ᥋᥈᥈᥈᥈ዶఋዶऊऊऊ᥈ఋ᥈ዶ᥈ऊఋऊऊዶऊ᥈᥋ሕࣕ
ϟᎮϟँ è ጢࣕ᥋ऊऊዶዶऊఋ᥈᥈᥈᥈ዶఋ᥈ዶ᥈ऊఋఋఋऊऊऊ᥋ሕࣕ
ϟᎮϟँ ኏ ጢࣕ᥋᥈᥈᥈ऊዶዶዶऊऊዶዶዶఋऊऊऊዶఋఋ᥈ऊఋऊऊ᥋ሕࣕ
᥋ϟ ᥋ϟ
ᓂ ɯᖔϟ঎ԡ ဂᓂ ኏᥋èྉ԰ԡ ဂቝᆍ᤟ኼᓂ ɯᖔϟ঎ԡ ဂᓂ ኏᥋኏ྉ԰ԡ
᥋ϟ
ဂቝᆍ᤟ኼᓂ ɯᖔϟ঎ԡ ဂᓂ 基因组 ᧕શዶྉϟԡԡ Ⴟ੫ɯ 和 ϟሕ঎ጢ
ဂᓂ ʛʛ̀ ᨃᤥ 扩增条件᧥ँ࿗ ቩ 预变性 ሕቝᔽႿᖔँ࿗ቩ 变
԰
性 ሕԡ ༁ᖔጢጢ ቩ 退火 ሕԡ ༁ᖔᎮ԰ ቩ 延伸 ϟᤃԡ ༁ᖔሕጢ 个循
环后 Ꭾ԰ ቩ 延伸 ϟԡ ቝᔽႿᤥ
ϟ঎԰঎԰ ۪ऊ኏ 产物连接及测序জ 参照 ۪ʢᆍቝᔀ੫ᑕ 公司胶
回收试剂盒操作方法回收 ۪ऊ኏ 产物ᖔ参照 ۪ʢᆍቝᔀ੫ᑕ
公司 ᡱ᥈ጶᥘ᥋ఋ ጶᑕ༁ᢃ ჆ᔀዹᡷᆍʢ ୩ᢃ༁ᡷᔀቝ 试剂盒说明将回
收的 ۪ऊ኏ 产物连接于 ᡱ᥈ጶᥘ᥋ఋ ጶᑕ༁ᢃ ჆ᔀዹᡷᆍʢᤥ 连接
有 ۪ऊ኏ 产物的 ᡱ᥈ጶᥘ᥋ఋ ጶᑕ༁ᢃ ჆ᔀዹᡷᆍʢ 导入大肠杆菌
ྉጛ໧ዞ၊ᓣʗᔠዞ၊ᔠᐹ ዞᅳᤀᔠɯ᧕̀ጢም 感受态菌株ᤥ 将工程菌送
至北京诺赛公司测序ᤥ 利用 ᧕શዶᥘዶશ ँ঎ԡ 软件中
ᥥ序列拼接功能ɼ 对测序结果进行拼接ᖔ将拼接结
果于 શऊା᧧ 数据库中比对ᖔ确认保守区ᤥ
ϟ঎԰঎ሕ ኏શዶ ᣰ ᧕શዶ 寡聚核苷酸嵌合体构建জ 基于烟
草品种 ጸ ᣽ሕ԰ᤃᆥ 的 ዛᒦ୒ 基因保守区的结构ᖔ 参照
᣽ᆍዹၤᔀ׹ᔀႿҴᆍ 和 ۼᔽ᤟᤟ቝᔽᡷझᔀʢྉ԰ԡԡሕɯ 的方法设计 ኏શዶ ᣰ
᧕શዶ 嵌合体序列ᖔ交由 ఋᑕ᣽ᑕ኏ᑕ 公司合成ᤥ 嵌合链
设计基本要求与靶基因的序列一样ྉ 除了突变位
点外ɯᖔ通过寡聚核苷酸链代换ᖔ引入靶位点碱基
序列变化ᤥ
ϟ঎԰঎࿗ 基因枪介导的 ኏શዶ ᣰ ᧕શዶ 导入烟草的愈伤组
织জ 参照谭颖等ྉ԰ԡϟሕɯ 的方法略有改动ᖔ对烟草
品种ጸ ᣽ሕ԰ᤃᆥ 的愈伤组织进行诱导ᤥ 烟草叶片经
Ꭾጢᠮ的酒精灭菌 ሕԡ ༁ᖔԡ঎ϟᠮ ̀੫ऊ᤟ 消毒 ऐቝᔽႿᖔ无
԰
菌水清洗 ሕጲጢ 次后切块ྉԡ঎ጢ ዹቝġԡ঎ጢ ዹቝɯ 接种于
愈伤诱导培养皿上ᖔ经过 ԰ 周诱导培养后ᖔ转接
于新鲜继代培养基上继续培养至出现分化芽点ᖔ
分化芽接种生根培养基上生根培养ᤥ 愈伤诱导
᥋ϟ ᥋ϟ
培养 基᧥ᥘ୩ շ ϟ঎ ጢ ቝ੫ ኼ ᓂ ᤃ᥋ାዶ շ ԡ঎ ϟ ቝ੫ ኼ ᓂ