Page 118 - 《广西植物》2022年第9期
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ϟ ጢ ጢ ࿗ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ 卷
᥋ϟ
શዶዶଫ继代 培养基᧥ᥘ୩ շ ϟ ԡ ቝ੫ ኼ ᓂ ᤃ᥋ାዶ շ ԡ 批次接种 ጢ 皿ᖔ每皿接种 ሕԡ ጲ ࿗ԡ 个愈伤组织ྉʛ ᢉ
᥋ϟ શዶዶᤥ 将 烟 草 愈 伤组织继代培养基分
ቝ੫ኼ ᓂ ԡጢ ዹቝɯᖔ共计 ँ ጢԡԡ ጲ ϟԡ ԡԡԡ 个愈伤组织块ᤥ
组ᖔ分别加入不同浓度的氯磺隆ᖔ对愈伤组织进 ϟጢ 抗性分化植株 ዶᓂ୩ 酶活的检测জ 参照陈以
行氯磺隆敏感性实验ᤥ 氯磺隆浓度梯度分别设 峰等ྉϟँँऐɯ的提取方法ᖔ取移栽后 ሕ 周的野生型
置为 ँԡܦ ϟԡԡܦ ϟϟԡܦ ϟԡܦ ϟሕԡܦ ϟ࿗ԡܦ ϟጢԡܦ ϟᤃԡ 烟草品种ጸሕᤃᆥ叶片 ϟ੫ᖔ加入提取介质ྉ 磷酸缓
Ⴟቝᆍኼᓂ ᤥ 每个皿接种相同数量ܦ生长状态近似 冲液 ዶɯϟ ቝᓂᖔ匀浆ᖔ ጢԡԡ ʢኼቝᔽႿ 离心 ԡ ቝᔽႿᖔ取
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的愈伤组织进行继代培养ᖔ培养条件为光照强度 上清液即为粗酶液ଫ取 ԡጢ ቝᓂ 反应介质ྉ 磷酸缓
为 ԡԡԡ ᖔ 每日光 照 ϟᤃ ၤᖔ 培养温度为 ྉᤃ ō 冲液 ାɯᖔ加入不同浓度的氯磺隆ᖔ这里设氯磺隆
ϟɯ ቩ ᤥ 培养 ϟ 周后观察愈伤组织生长情况ᤥ 抗 浓度梯度为 ԡ ጲ ጢԡԡ Ⴟቝᆍኼᓂ ଫ加入 ሕԡ ဂᓂ 粗酶液ᖔ
᥋ϟ
性芽生根培养基᧥ϟ ᣰ ᥘ୩ շ ԡϟ ቝ੫ኼᓂ શዶዶᤥ 愈 总体积 ԡँ ቝᓂᖔ蒸馏水补齐ᖔሕᎮ ቩ 温育 ϟၤᖔ加入
᥋ϟ
伤诱导培养基和继代培养基中补加 ሕԡ ੫ኼᓂ 蔗 ጢԡ ဂᓂ ሕ ቝᆍኼᓂ 的 ̀ ୩ᨃ 中止反应ଫ依次加入 ԡጢ
᥋ϟ
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࿗
᥋ϟ ᥋ϟ
糖和 ऐ੫ኼᓂ 琼脂ᖔ生根培养基中补加 ሕԡ ੫ኼᓂ ቝᓂ ԡ ऐሕᠮ 甲萘酚和 ԡ ጢ ቝᓂ 肌酸ᖔᤃԡ ቩ 温育 ϟጢ
᥋ϟ ᥋ϟ
蔗糖和 ᤃ੫ኼᓂ 琼脂ᖔ各培养基 ᡱ̀ 均为 ጢऐᤥ ቝᔽႿᖔ将溶液于 ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ 离心 ϟԡ ቝᔽႿᖔ取上清
基因枪微弹的制备参照 ାᔽᆍ᥋ᑕʛ ۪᧕୩᥋ϟԡԡԡ̀ᔀ 液于分光光度计 ጢሕԡ Ⴟቝ 比色ᤥዶᓂ୩ 活性直接用
使用说明书ᖔ根据程义琳等ྉԡϟሕɯ 的方法ᖔ略有改 ዶጢሕԡ Ⴟቝ 值来表示ᤥ 以野生型烟草品种ጸሕᤃᆥ 为
动ᤥ 设计基因枪轰击实验流程᧥称取 ऐቝ੫ 金粉置 对照ᖔ测定抗性植株的 ዶᓂ୩ 酶活ᤥ
于 ϟጢ ቝᓂ ጶ۪ 管中ଫ加入 ϟቝᓂ 无水乙醇ᖔ漩涡震荡 ϟᤃ 抗性分化植株突变位点验证জ 根据烟草品种
ሕ ጲ ጢ ቝᔽႿᖔϟԡ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ 离心 ϟቝᔽႿᖔ弃上清液ྉ 重 ጸሕᤃᆥ的 ዛᒦ 基因突变位点ᖔ选择跨该区段的引物
᥋ϟ
复 ሕ 次ɯଫ加入 ϟቝᓂ 无菌水ᖔ震荡 ϟቝᔽႿଫ加入 ϟሕሕ 进行扩增ᖔ扩增后进行测序ᖔ分析拟突变位点的变
ဂᓂ 无菌水ᖔ储存在ͱԡ ቩ 待用ଫ加入 ϟሕሕ ဂᓂ 嵌合 化情况ᖔ۪ऊ 产物扩增ܦ连接及测序参照 ϟᤥ
体震荡 ጲሕ ༁ଫ加入 ϟሕሕ ဂᓂ ጢ ቝᆍኼᓂ ऊᑕऊ 震荡
᥋ϟ
ጲሕ ༁ଫ加入 ጢሕሕ ဂᓂ ԡϟ ቝᆍኼᓂ ༁ᡱᔀʢቝᔽʛᔽႿᔀᖔ震荡 জ 结果与分析
᥋ϟ
ጲሕ ༁ଫ在冰上静置 ϟԡ ቝᔽႿᖔϟԡ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ 离心
᥋ϟ
ϟԡ ጲ ԡ ༁ᖔ弃上清液ଫ加入 ጢԡԡ ဂᓂ 无水乙醇ᖔ冲洗 ԣॹϓ 烟草品种ጝᣞᇺԣᣤᆋ的 ዛᒦ 基因克隆
次ᖔ离心 ϟԡ ༁ᖔ弃上清液ଫ加入 ϟᤃԡ ဂᓂ 无水乙醇ᖔ均 以烟草品种ጸ ሕᤃᆥ 基因为模板ᖔ利用引物对
匀后ᖔ࿗ ቩ 备用ྉ每次使用 ϟԡ ဂᓂɯᤥ ୩ࣼዶ èᣰ ୩ࣼዶ 和 ୩ࣼା èᣰ ୩ࣼା 进行 ۪ऊ 扩
基因枪介导的 શዶ ᣰ ᧕શዶ 导入烟草愈伤组织ᖔ 增ᖔ均扩增得到一条长度约为 ԡԡԡ ᤦᡱ 的条带ᖔ且扩
参照 ᆍዹၤᔀᔀႿҴᆍ 和 ۼᔽቝᔽᡷझᔀʢ ྉ ԡԡሕɯܦ 程义琳等 增条带清晰明亮ᤥ 将该 ۪ऊ 产物分别胶回收后以
ྉԡϟሕɯ的方法ᖔ略有改动ᤥ 具体操作᧥打开超净 ᡱ᥈ጶᥘ᥋ఋ ጶᑕ༁ᢃ ᔀዹᡷᆍʢ 进行连接ᖔ连接后的质粒载体
台ᖔ用 Ꭾԡᠮ乙醇擦拭超净台内部与基因枪的表面 导入大肠杆菌 ᧕̀ጢም 感受态菌株筛选阳性菌落ᖔ阳
及基因枪内部ଫ打开紫外灯ᖔ灭菌 ሕԡ ቝᔽႿᖔ灭菌后 性菌落送至北京诺赛公司进行测序ᤥ 测序拼接结
吹风 ԡ ቝᔽႿଫ易裂片ܦ微弹载体及阻拦网置于 Ꭾԡᠮ 果表明ᖔ以 ୩ࣼዶ èᣰ ୩ࣼዶ 引物扩增到序列长度为
乙醇 ϟԡ ቝᔽႿᖔ放在无菌滤纸上自然晾干ଫ打开氦气 ԡԡ࿗ ᤦᡱ 的基因ᖔ命名为ጸሕᤃᆥ ዛᒦ ࣩቴዛᖔ而以
瓶ᖔ将压力调制 ϟ ϟԡԡ ᡱ༁ᔽଫ将易裂片ܦ微弹载体及 ୩ࣼା èᣰ ୩ࣼା 扩增到序列长度为 ԡϟԡ ᤦᡱ 的基
阻拦网安装并固定在基因枪真空室ᖔ将带有烟草 因ᖔ命名为ጸ ሕᤃᆥ ዛᒦ ࣩቴଧྉ图 ɯᤥ
愈伤组织的培养皿放在托盘上ᖔ调节轰击距离为 ँ ԣॹԣ ቴટዛ ᣑ ᦵટዛ 寡聚核苷酸嵌合体设计
ዹቝᖔ关闭基因枪门ᖔ打开电源及真空泵ଫ按下真空 参照 ᆍዹၤᔀᔀႿҴᆍ 和 ۼᔽቝᔽᡷझᔀʢྉԡԡሕɯ 的方法ᖔ
键ᥥዶऊɼᖔ当真空表读数为 ጢ ᔽႿ̀੫ 时ᖔ按维持键 结合ጸሕᤃᆥዛᒦ ࣩቴዛ 和ጸሕᤃᆥዛᒦ ࣩቴଧ 基因保
ᥥ̀ᆍʛɼଫ按下ᥥèᔽʢᔀɼ 键ᖔ轰击结束ᖔ按下ᥥ 通气键ɼ 守序列的比对ᖔ设计以ጸ ሕᤃᆥ ዛᒦ 基因编码区第
至真空表读数为零ᤥ 打开基因枪门ᖔ取出培养皿ᖔ ጢऐऐ 位核苷酸由胞嘧啶ྉዹᢃᡷᆍ༁ᔽႿᔀᖔऊɯ 突变为腺嘌呤
盖好盖子用封口膜封好ᖔ转入组培室ᖔ暗恢复 ʛ ྉᑕʛᔀႿᔽႿᔀᖔዶɯ 的颠换ᖔ第 ϟᎮϟँ 位核苷酸由鸟嘌呤
后ᖔ氯磺隆筛选培养ᖔ温度为ྉᤃ ō ϟɯቩ ᖔ光照强 ྉ੫ࣼᑕႿᔽႿᔀᖔ᥈ɯ突变为胸腺嘧啶ྉᡷၤᢃቝᔽႿᔀᖔఋɯ的颠换ᤥ
度为 ԡԡԡ ᖔ光照时间为 ϟᤃ ၤᤥ 共做 ϟ 批次ᖔ每 针对 ዛᒦ 编码区核苷酸第 ጢऐऐ 位点ܦ ϟᎮϟँ 位点设
