Page 117 - 《广西植物》2023年第1期

１ 期 欧阳志伟等: 岩黄连乙酸乙酯部位化学成分及其抗炎活性研究 １ １ ３

Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 凝胶(美国 ＧＥ 公司)ꎻＭＣＩ 柱色谱 (４.６ ｍｇ)ꎻＦｒ.８－３ 经 ＭＣＩ 柱色谱处理后经制备型
(日本三菱公司)ꎮ 甲醇( 色谱纯ꎬ美国 ＴＥＤＩＡ 公 ＨＰＬＣ(甲醇－水ꎬ７２ ∶ ２８ꎬ Ｖ / Ｖ)纯化后得到化合物
司)ꎻ乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂( 分析纯ꎬ西陇 １１(３.４ ｍｇ)、１２(１１８.６ ｍｇ)ꎻＦｒ.８－４和 Ｆｒ.８－５ 经制
化工股份有限公司)ꎻ甲醇、三氟乙酸( ＴＦＡ) 溶剂 备型 ＨＰＬＣ(甲醇－水ꎬ７８ ∶ ２２ꎬ Ｖ / Ｖ)纯化后得到化

(色 谱 纯ꎬ 上 海 泰 坦 科 技 股 份 有 限 公 司 )ꎻ 合物 １３(３.７ ｍｇ)ꎮ 化合物的结构如图 １ 所示ꎮ
ＲＡＷ２６４.７ 巨噬细胞( 中科院上海生命科学研究 １.４ 细胞的培养及毒性评价
院)ꎻ一氧化氮( ＮＯ) 试剂盒( 碧云天公司ꎬ批号为 ＲＡＷ２６４. ７ 细 胞 在 含 有 １０％ 胎 牛 血 清 的
０２２４２１２１０６０８)ꎻ噻 唑 蓝 ( ＭＴＴ) 粉 剂 ( Ｓｏｌａｒｂｉｏ 公 ＤＭＥＭ 培养液中于 ３７ ℃ 、５％ ＣＯ 条件下培养ꎬ生
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司ꎬ批号为 １２２３Ｇ０５３１)ꎻ脂多糖( Ｓｏｌａｒｂｉｏ 公司ꎬ批 长至 ７０％ 时 进 行 传 代ꎮ 采 用 ＭＴＴ 法 ( Ｍｏｓｍａｎｎꎬ
号 为 ４２６Ｙ０３１)ꎻ ＤＭＥＭ 基 础 培 养 基、 胎 牛 血 清 １９８３) 检 测 化 合 物 对 ＲＡＷ２６４. ７ 细 胞 存 活 率 的
(Ｇｉｂｃｏ 公司ꎬ批号为 ２１１０８７５ＣＰ)ꎻ吲哚美辛( 西亚
影响ꎮ
公司ꎬ批号为 Ｙ２４６２)ꎮ 将对数生长周期的 ＲＡＷ２６４.７ 细胞株ꎬ按照
１.３ 提取和分离 １８０ μＬ 每孔的体积将浓度为 １×１０ 个ｍＬ 的细
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参考 Ｚｈａｎｇ 等(２０１６) 的方法并有所改动ꎮ 将 胞悬浮液接种于 ９６ 孔板中ꎬ同时设置空白组、吲
９ ｋｇ 岩黄连全草药材粉碎后ꎬ加入 ５０ Ｌ 石油醚回 哚美辛组以及给药组(５０ μｍｏｌＬ )ꎬ每组设 ３ 个
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流 ３ ｈ 去除叶绿素ꎬ过滤后再加入 ９５％乙醇回流提
复孔ꎬ于 ５％ ＣＯ 、３７ ℃ 条件下培养 ２４ ｈꎮ 在避光
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取 ３ 次ꎬ每次 ３ ｈꎬ将提取液合并浓缩得到浸膏 ０.７
条件下每孔加入 １０ μＬ ５ ｇＬ 的 ＭＴＴ 溶液ꎬ继续
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ｋｇꎮ 将浸膏溶于 １ Ｌ ３％的酒石酸溶液( ｐＨ ＝ ２ ~
于 ５％ ＣＯ 、３７ ℃ 条件下孵育 ４ ｈꎬ弃去培养液ꎬ每
３)ꎬ依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取 ３ 次ꎬ浓 ２
孔加入 １００ μＬ ＤＭＳＯ 试剂充分溶解后用酶标仪在
缩得石油醚部位 １００ ｇ、乙酸乙酯部位 ６０ ｇ、正丁醇
５７０ ｎｍ 波长处测量吸光度 ＯＤ 值ꎬ并根据 ＯＤ 值计
部位 ６０ ｇꎮ
算 ＲＡＷ２６４.７ 细胞的存活率ꎮ 计算公式如下:
取乙酸乙酯部位(６０ ｇ)ꎬ用 ＡＢ￣８ 大孔树脂初
存活率 ＝ (ＯＤ ) / (ＯＤ ) ×１００％
步分离ꎬ乙醇－水(０ ∶ １００→１００ ∶ ０ꎬ Ｖ / Ｖ) 梯度洗 给药组 空白组
１.５ 抗炎活性评价
脱ꎬ得到 Ｆｒ.１ ~ Ｆｒ.８ 共 ８ 个组分ꎮ Ｆｒ.３ 经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ
细胞分为 ４ 组ꎬ分别为空白组、ＬＰＳ 炎症模型
ＬＨ￣２０ 凝胶柱( 甲醇 －水ꎬ３０ ∶ ７０→１００ ∶ ０ꎬ Ｖ / Ｖ)
组、不同浓度给药组(测试化合物及阳性药吲哚美
分离ꎬ得到 Ｆｒ. ３ － １ ~ Ｆｒ. ３ － ８ 共 ８ 个组分ꎮ 其中ꎬ
辛)ꎬ每个浓度设置 ３ 个复孔ꎬ取对数生长周期的
Ｆｒ.３－２经制备型 ＨＰＬＣ( 甲醇－０.１％ ＴＦＡꎬ４５ ∶ ５５ꎬ
ＲＡＷ２６４.７ 细胞株ꎬ以 １×１０ 个ｍＬ 的密度接种
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Ｖ / Ｖ)纯化 后 得 到 化 合 物 １ ( １６ ｍｇ)、２ ( １５ ｍｇ)ꎻ
于 ９６ 孔板中ꎬ培养箱培养 ２４ ｈ 后给药ꎮ 空白组加
Ｆｒ.３－４ 经制备型 ＨＰＬＣ(甲醇－０.１％ ＴＦＡꎬ４０ ∶ ６０ꎬ
入完全培养基ꎬ给药组加入不同浓度的化合物ꎬ继
Ｖ / Ｖ)纯化后得到化合物 ３(８３.７ ｍｇ)ꎻＦｒ.３－５ 经制
续培养孵育 ４ ｈ 后和 ＬＰＳ 炎症模型组一起加入质
备型 ＨＰＬＣ( 甲醇－０.１％ ＴＦＡꎬ４０ ∶ ６０ꎬ Ｖ / Ｖ) 纯化
量浓度为 １ ｍｇＬ 的 ＬＰＳꎬ继续于细胞培养箱中
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后得到化合物 ４(１０ ｍｇ)、５(１０ ｍｇ)ꎻＦｒ.３－６ 经制
备型 ＨＰＬＣ( 甲醇－０.１％ ＴＦＡꎬ４０ ∶ ６０ꎬ Ｖ / Ｖ) 纯化 培养 ２４ ｈꎮ
１.６ ＮＯ 含量测定
后得到化合物 ６(１４ ｍｇ)ꎻＦｒ.３－８ 经制备型 ＨＰＬＣ
(甲醇－０.１％ ＴＦＡꎬ４５ ∶ ５５ꎬ Ｖ / Ｖ) 纯化后得到化合 采用 Ｇｒｉｅｓｓ 法 ( Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９８２ꎻ 焦 兵 等ꎬ
２０１９)测定给药组对 ＬＰＳ 诱导的 ＲＡＷ２６４.７ 细胞
物 ７(１１.７ ｍｇ)、８(７ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ.５ 经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０
上清液中 ＮＯ 的含量ꎬ收集各组细胞上清液ꎬ严格
凝胶柱( 甲醇－水ꎬ ３０ ∶ ７０→１００ ∶ ０ꎬ Ｖ / Ｖ) 分离ꎬ
得到 Ｆｒ.５ － １ ~ Ｆｒ.５ － ５ 共 ５ 个组分ꎮ 其中ꎬＦｒ.５ － ５ 按照 ＮＯ 检测试剂盒说明书进行测定ꎮ
经制备型 ＨＰＬＣ( 甲醇－水ꎬ３５ ∶ ６６５ꎬ Ｖ / Ｖ) 纯化后 １.７ 统计学分析
得到化合物 ９(６.１ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ.８ 经硅胶柱色谱( 二氯 利用 ＳＰＳＳ ２１.０ 软件进行数据处理和统计学
甲烷－甲醇) 进行分离ꎬ得到 Ｆｒ.８ － １ ~ Ｆｒ.８ － ６ 共 ６ 分析ꎻ以半抑制浓度(ＩＣ )值表示化合物体外抗炎
５０
个组 分ꎮ 其 中ꎬ Ｆｒ. ８ － １ 经 制 备 型 ＨＰＬＣ ( 甲 醇 － 活性强度ꎬ每个实验重复 ３ 次ꎬ所有数值均以 ｘ±ｓ
０.１％ ＴＦＡꎬ７５ ∶ ２５ꎬ Ｖ / Ｖ) 纯化后得到化合物 １０ 形式表示ꎮ