Page 140 - 《广西植物》2022年第12期

２ １ ３ ０ 广 西 植 物 ４２ 卷
Ｒａｂ１８ 在转录与翻译水平上均显著富集ꎬ为莲胚应 取出莲子ꎬ测定每组莲子种芽长度并计算发芽率
对逆境胁迫可能发挥重要作用ꎮ ( 以胚芽突破果皮作为发芽标准) ꎮ 根据不同处
莲子是目前寿命最长的种子之一ꎬ莲种胚作 理组在莲种胚萌发状态、发芽率上的差异ꎬ确定
为莲子中最具萌发活力的组织ꎬ因其具备较好的 适宜的胁迫处理温度( 张陇艳等ꎬ２０２１) ꎮ
储藏耐性和抗逆能力而成为研究植物种子抗高温 １.２.３ 生理指标测定 参考刘丽等(２０２１) 的方法
与超低温的优良材料ꎮ 吕珊(２０２０) 前期研究证实 且优化ꎬ选定吸水 ３、６、１２、１８、２４、３６ ｈ 作为取样时
莲子的脱水耐性与其种胚特殊的抗逆保护机制有 间点ꎬ完成各组莲子的相对电导率、鲜重及含水量
关ꎬ但莲种胚在不同温度逆境下抗逆机制如何发 的测定ꎬ选择具有显著性差异的时间作为适宜的
挥作用的科学问题至今尚未彻底阐明ꎮ 本研究通 生理取样点ꎮ 采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法完成蛋白浓度标准
过高温和超低温处理ꎬ从形态学、抗性生理和基因 曲线的绘制ꎬ以及考马斯亮蓝法测定莲胚的可溶
定量 ３ 个层面ꎬ对莲种胚的抗高温与超低温能力 性蛋白(ＳＰ)含量ꎮ 采用 ＴＢＡ 法(冯建灿等ꎬ２００２)
做出科学评价ꎬ初步揭示莲种胚细胞在不同温度 测定丙二醛( ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅꎬＭＤＡ) 含量ꎬ结合相
处理下的生理响应规律ꎮ 莲组织培养是品种快繁 对电导率评价莲胚在吸水萌发过程中的质膜完整
和遗传转化的重要技术ꎬ而莲子作为组织培养中
性ꎻ采用比色法进行测定 ＳＯＤ 含量( Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ
重要的外殖体材料ꎬ因其含有大量的内生菌ꎬ从而
２０１４)、 愈 创 木 酚 法 测 定 ＰＯＤ 含 量 ( Ｏｍｒａｎꎬ
导致组培过程中以莲子作为外殖体染菌率高、成
１９８０)、紫外分光光度法测定 ＣＡＴ 活性( Ｓｉｎｇｈ ｅｔ
功率低(赵文进ꎬ２０１３)ꎮ 因此ꎬ探究莲胚在不同温
ａｌ.ꎬ ２０１０)ꎻ参考南京建成生物公司的试剂盒使用
度下的响应规律ꎬ以期为开展以莲胚作为组培外
说明测定 ＧＳＨ 和 ＡｓＡ 含量ꎻ参考 Ｊｉａｎｇ 等(２０１３)
殖体材料的高温杀菌技术、优化莲子超低温保存
方法ꎬ测定 ＲＯＳ 组分中的 Ｈ Ｏ 水平、Ｏ 抑制能
－
方法提供技术指导ꎬ同时为拓展莲种质资源的保 ２ ２ ２
力和ＯＨ抑制能力ꎻ采用酸性茚三酮法测定游离
存途径、揭示莲子特殊的抗逆能力奠定理论基础ꎮ
Ｐｒｏ 含量(李绍军等ꎬ２００５)ꎮ 依据以下的胁迫耐受
指数公式计算:
１ 材料与方法
胁迫耐 受 指 数 ( ＳＲ) ＝ Ｐｓ / Ｐｃ 计 算 胁 迫 耐
受值ꎮ
１.１ 材料
式中: Ｐｓ 为胁迫条件下的脯氨酸含量ꎻＰｃ 为
所用材料为太空莲 ３６ 号成熟莲子ꎬ产自江苏
正常条件下脯氨酸含量ꎮ
宿迁ꎮ
１.２.４ 莲胚抗逆基因的选择与实时荧光定量 ＰＣＲ
１.２ 方法
检测 选择 ＡＣＴＩＮ２ 作为内参基因(徐君等ꎬ２０１９)ꎬ
１.２.１ 高温与超低温处理 选取大小一致、成熟饱
登陆 ＮＣＢＩ 下载 ＯＸＩ１、Ｒａｂ１８、Ｃｕ / Ｚｎ ＳＯＤ、Ｍｎ ＳＯＤ、
满的莲子进行分组ꎬ并采用不同温度处理ꎮ 高温
ＣＡＴ１、 ＰＯＤ４１、 ＰＯＤ７３、 ＡＰＸ、 ＧＲ 基 因 序 列ꎬ 使 用
处理参考楚璞(２０１１) 的方法并加以改进ꎬ参考黄
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 设 计 引 物 如 表 １ 所 示ꎮ 莲 胚 的
上志等(２００３) 、路蕾等(２０１３) 的研究方法ꎬ将去
ＲＮＡ 提取参考 ＴａＫａＲａ 公司的 ＲＮＡ 提取试剂盒说
壳莲子置于 ７０、８０、９０、１００ ℃ 烘箱中处理 １２ ｈꎻ
ＴＭ
明书 进 行ꎬ 反 转 录 参 考 ＴａＫａＲａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ
超低温处理是将莲子置于 － ８０ ℃ 冰箱中处理 １２
ｈ( 刘伟 等ꎬ２０２０) ꎬ 液 氮 中 处 理 ３０ ｍｉｎ ( 王 婷 婷 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)的使用说明ꎬ将得到
®
的 ｃＤＮＡ 作 为 模 板ꎬ 参 考 Ｔａｋａｒａ 公 司 的 ＳＹＢＲ
等ꎬ２０１４) ꎬ处理后将各组莲子置于室温下过夜ꎮ
ＴＭ
每个处理组设置 ３ 组重复ꎬ每组 ２０ 粒莲子ꎮ 以 Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ￣ＰＣＲ ＫｉｔⅡ试剂盒的使用说明ꎬ用
－ΔΔＣｔ
２ 法进行基因相对表达量分析ꎮ
开壳后室温静置 ２４ ｈ 的莲子作为对照组( ＣＫ) ꎮ
１.２.２ 形态指标测定 将 ＣＫ 组与处理组的莲子 １.２. ５ 数 据 处 理 与 分 析 使 用 ＳＰＳＳ ２４. ０ 和
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ 软件计算各指标的平均值和标准
置于 黑 色 塑 料 盒 中 吸 水 萌 发ꎬ 于 ２５ ℃ / ２０ ℃
( 昼 / 夜) 、１６ ｈ 光周期( 光强 ３ ０００ ｌｘ) 的恒温光 误ꎬ使用 ＬＳＤ 和 Ｄｕｎｎｅｔｔ 软件检验进行差异显著性
照培养箱中培养ꎮ 每天换 ２ 次水并拍照记录莲 以及相关性分析ꎬ统计结果使用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ 及
种胚的萌发状态( 王毅敏等ꎬ２０２１) ꎮ 培养 ７ ｄ 后 Ｏｒｉｎｇｉｎ ９ 软件进行图形绘制ꎮ