Page 121 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期 熊泽浩等: 甜荞花青素合成相关基因 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 的克隆与表达分析 １ ２ ８ ９
ＰｈＭＹＢ２７ 等(Ｔａｍａｇｎｏｎｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９８９ꎻ Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ 级 结 构ꎻ 利 用 在 线 软 件 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( ｈｔｔｐ: / /
２０１４)ꎮ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ / ｓｏｆｔｗａｒｅ) 预测启动子中
本课题组通过杂交选育获得一份富含花青素 的顺式作用元件ꎻ利用 ＮＣＢＩ 进行 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌａｓｔ 搜
的甜荞( Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ) 新品种ꎬ命名为红 索同源序列ꎬ将同源序列用 ＭＥＧＡ Ｘ 软件构建进
花甜荞( ＨＨＴＱ)ꎬ通过与白花的甜荞品种( 北早 化树ꎬ 采 用 的 方 法 为 邻 接 法ꎬ 设 置 重 复 次 数
生)进行转录组学对比分析ꎬ挖掘了一批控制甜荞 (ｂｏｏｔｓｔｒａｐ)为 １ ０００ 次ꎮ
花青素合成的候选基因(Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ 本研 １.４ 甜荞 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白的亚细胞定位
究从 ＨＨＴＱ 中克隆了调控花青素生物合成的候选 利用 ＢｉｏＸＭ ２.６ 软件和 ＤＮＭＡＮ 软件设计特
基因 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢꎬ并通过生物信息学的方法ꎬ从 异性引物 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢＦ￣Ｆ１ 和 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢＦ￣Ｒ１
基因结构、系统发育进化树、多序列比对、功能结 (表 １ )ꎮ 运 用 ＰＣＲ 扩 增 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基 因ꎬ 经
构域分析和启动子顺式作用元件等方面对该基因 Ｘｈｏ Ⅰ 和 Ａｖｒ Ⅱ 限制性内切酶双酶切ꎬ胶回收酶
的基本特征进行全面的预测分析ꎬ以及通过亚细 切片段ꎬ将回收片段与 ｐＨＺＭ２７ 载体连接ꎬ转化
胞定位和 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 研究了 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因的 ＤＨ５αꎬ提 取 质 粒 ３５Ｓ ∷ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣ＧＦＰꎮ 使 用
表达特征和组织表达模式ꎬ为进一步探究 ＦｅＲ２Ｒ３￣ 农杆菌感受态细胞 ＧＶ３１０１ꎬ转化重组质粒ꎬ送至
ＭＹＢ 基因在荞麦花青素生物合成过程中的功能提 北京擎科技术有限公司进行测序ꎬ备用ꎮ 取 ４ ~ ５
供了理论依据ꎮ 叶龄的烟草ꎬ利用注射法转化烟草ꎮ 将注射后的
烟草放置 ４８ ~ ７２ ｈꎬ利用激光共聚焦显微镜观察荧
１ 材料与方法 光信号ꎮ
１.５ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因的表达差异
１.１ 材料 提取叶片和花序的总 ＲＮＡꎬ利用 ｃＤＮＡ 进行
所选材料品种为红花甜荞( ＨＨＴＱ) 和北早生ꎬ 实时 荧 光 定 量 ＰＣＲ ( ｑＲＴ￣ＰＣＲ)ꎬ 检 测 ＦｅＲ２Ｒ３￣
种于长江大学农学院实验基地ꎬ采用常规大田管 ＭＹＢ 基因在红花甜荞( ＨＨＴＱ) 和北早生不同部位
理ꎮ 待荞麦生长至第 ５ 个星期时ꎬ取其叶片和花 的表达模式ꎮ 使用 Ｐｒｉｍｅｒ 进行特异性引物设计ꎬ
序保存于 －８０ ℃ 冰箱中备用ꎮ 上、下 游 特 异 性 引 物 分 别 为 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｆ２ /
１.２ 甜荞 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因的克隆 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｒ２(表 １)ꎻ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测所用的阳
利用 ＲＮＡ 试剂盒(北京艾德莱生物科技有限 性对照内参基因为甜荞的 ＡＣＴＩＮ 基因( ＧｅｎＢａｎｋ
公司) 提取 ＨＨＴＱ 叶片的总 ＲＮＡꎬ利用反转录试 登录号: ＨＱ３９８８５５. １)ꎬ检 测 特 异 性 引 物 分 别 为
剂盒(宝日医生物技术有限公司) 合成 ｃＤＮＡꎮ 根 ＱＦｅＡＣＴＩＮ￣Ｆ 和 ＱＦｅＡＣＴＩＮ￣Ｒ(表 １)ꎮ 采用两步法
－ΔΔＣｔ
据本实验室前期转录组学数据得到的 ＭＹＢ 序列ꎬ ＰＣＲ 扩增程序ꎬ使用 ２ 法计算表达量ꎬ用 ＳＰＳＳ
通过 ＮＣＢＩ 进行 Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ 设计特异性引物( 表 １９.０ 软件对数据进行显著性分析ꎬ用 Ｅｘｃｅｌ ２００３
１)ꎬＰＣＲ 扩增出 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 序列ꎬ构建克隆载体 软件作图ꎮ
后送至北京擎科技术有限公司进行 ＤＮＡ 测序ꎮ
１.３ 甜荞 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因的生物信息学分析 ２ 结果与分析
测序得到序列后ꎬ利用 ＡｐＥ(Ａ ｐｌａｓｍｉｄ Ｅｄｉｔｏｒ)
软件分析 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因的开放式阅读框和预 ２.１ 甜荞 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因的克隆
测其编码的氨基酸序列ꎻ利用在 线 网 站 ＥｘＰＡＳｙ 以 ＨＨＴＱ 的 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬ 利 用 引 物
(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ )预测蛋白等电 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｆ / ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｒ 进行扩增ꎬ用 １０
点和相对分子质量ꎻ利用在线网站 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 分析 ｇＬ 的琼脂糖凝胶电泳对 ＰＣＲ 产物进行检测ꎬ
￣１
蛋白 的 疏 水 性 / 亲 水 性ꎻ 利 用 ＦｏｌｄＩｎｄｅｘ 程 序 对 获得一条 ９００ ｂｐ 左右的 ＰＣＲ 产物ꎬ如图 １ 所示ꎮ
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋 白 进 行 无 序 化 预 测ꎻ 利 用 软 件 测序结果显示该片段大小为 ８７３ ｂｐꎬ利用 ＡＰＥ 软
＠ 件分析序列ꎬ发现含有 ８３１ ｂｐ 的开放阅读框ꎬ编码
ＮＰＳ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ) 预 测 ＦｅＲ２Ｒ３￣
ＭＹＢ 蛋白二级结构ꎻ利用 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ( ｈｔｔｐｓ: / / ２７６ 个氨基酸ꎮ 通过 ＢＬＡＳＴ 同源性搜索ꎬ结果显
ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / )预测 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白三 示其序列与苦荞麦 ＦｔＭＹＢ１５(ＫＹ２９０５８１.１)的相似
