Page 122 - 《广西植物》2023年第7期

１ ２ ９ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
表 １ 引物名称与序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
引物名称 引物序列 (５′￣３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) Ｐｕｒｐｏｓｅ
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｆ ＴＧＧＧＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣ 基因全长克隆上游引物
Ｇｅｎｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｒ ＴＧＧＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＧ 基因全长克隆下游引物
Ｇｅｎｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃｌｏｎｉｎｇ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｆ１ ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴ 亚细胞定位克隆上游引物
Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｒ１ ＴＣＣＣＣＴＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＴＴＣＴ 亚细胞定位克隆下游引物
Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｆ２ ＴＧＣＣＣＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡ 荧光定量基因上游引物
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣Ｒ２ ＧＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＣ 荧光定量基因下游引物
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ
ＱＦｅＡＣＴＩＮ￣Ｆ ＡＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＴＴＡＣ 荧光定量内参上游引物
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ
ＱＦｅＡＣＴＩＮ￣Ｒ ＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＡＧＴＴＣ 荧光定量内参下游引物
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ

性 高 达 ９７％ꎬ 将 该 基 因 命 名 为 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢꎬ 所示ꎬＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白三级结构以 α￣螺旋和无
ＧｅｎＢａｎｋ 登录号为 ＭＴ１５１３８１.１ꎮ 规则卷曲为主ꎬ与二级结构预测结构基本相同ꎮ
２.２ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因编码蛋白理化性质的预测 ２.４ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因编码蛋白的氨基酸序列比

通过在线软件 ＥｘＰＡＳｙ 预测到 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 对及进化分析
基因编码蛋白的相对分子质量为 ３０.９５ ｋＤꎬ理论 将 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白序列在 ＮＣＢＩ 数据库中
等 电 点 ( ｐＩ ) 为 ８. ７３ꎬ 蛋 白 的 分 子 式 为 进行 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌａｓｔ 搜索ꎬ筛选出 １５ 个植物蛋白序

Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎮ 其中 甘 氨 酸 ( Ｇｌｙ)、 亮 氨 酸 列ꎬ用 ＭＥＧＡ ７.０ 构建系统进化树ꎮ 如图 ３ 所示ꎬ
１３４２ ２１３４ ４００ ４１２ １５
(Ｌｅｕ)的含量最高ꎬ为 ９.１％ꎬ其次为丝氨酸( Ｓｅｒ) 甜荞的 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 与苦荞麦( ＡＰＺ７４３４０.１)、虎
的 ８.３％、谷氨酸(Ｇｌｕ)的 ７.６％ꎬ尿蛋氨酸( Ｍｅｔ) 的 杖(ＡＱＹ５６６７６.１)、拟南芥( ＮＰ ＿１９５５７４.１) 和蔷薇

含量最少ꎬ为 １.４％ꎮ 蛋白的不稳定指数为 ６９.６４ꎬ 杂交种( ＡＩＤ２３８９１.１) 的亲缘关系较近ꎬ苦荞麦和
推测 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 属于不稳定蛋白ꎮ ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 在 虎杖与甜荞同属蓼科植物ꎬ这些亲缘关系符合植

线软 件 分 析 蛋 白 的 疏 水 性 / 亲 水 性ꎬ 结 果 表 明ꎬ 物形态学分类及进化规律ꎮ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 在荞麦
ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 亲水区域大于疏水区域ꎬ总疏水值 和虎杖中有较高同源性ꎬ推测 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因
为－ ０. ６７９ꎬ 疏 水 最 大 值 为 １. ８１１ꎬ 亲 水 最 大 值 为 在双子叶蓼科植物中存在着较高的保守性ꎮ

－２.７１１ꎬ整条肽链呈现亲水特性ꎮ 通过 ＤＮＡＭＡＮ ６.０ 对 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 与其他进
２.３ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白的无序性分析和二级、三 化关系较近的不同植物 ＭＹＢ 氨基酸序列进行比
级结构预测 对ꎮ 结 果 如 图 ４ 所 示ꎬ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 与 苦 荞 麦
通过 ＦｏｌｄＩｎｄｅｘ 程序对 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白进 (ＡＰＺ７４３４０.１)的相似度最高ꎬ为 ９３.０８％ꎬ与虎杖

行无序化预测分析ꎬ该蛋白整个氨基酸序列中有 ９ (ＡＱＹ５６６７６.１)、蔷薇杂交种(ＡＩＤ２３８９１.１) 也有较
个无序化区域ꎬ共有碱基 １５１ 个ꎬ无序化比率为 高的 相 似 度ꎮ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 具 有 典 型 的 Ｒ２Ｒ３￣
５４.７１％ꎮ 利用软件 ＮＰＳ 预测 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白 ＭＹＢ 结构域ꎬ属于 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 亚家族ꎮ
＠
二 级 结 构ꎬ 结 果 表 明ꎬ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋 白 由 ２.５ ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白的亚细胞定位
２６.８１％的 α￣螺旋、１０.５１％ 的延伸链、５.０７％ 的 β￣ 将 ３５Ｓ ∷ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ￣ＧＦＰ 和 ｐＨＺＭ２７(３５Ｓ ∷
转角和 ５７.６１％的无规则卷曲组成ꎮ 利用 ＳＷＩＳＳ￣ ＧＦＰ)空载体瞬时转化烟草ꎬ通过激光共聚焦显微
ＭＯＤＥＬ 预测 ＦｅＲ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白三级结构ꎬ如图 ２ 镜发现(图 ５)ꎬ转化空载体 ３５Ｓ∷ＧＦＰ 的烟草细胞