Page 142 - 《广西植物》2023年第7期

１ ３ １ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
的巨大侧耳菌株为材料ꎬ采用单因素和正交试验 脱脂棉过滤后ꎬ３ ０００ ｒｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎬ倒掉上
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的方法ꎬ对巨大侧耳原生质体制备中的菌丝体菌 清液ꎮ 用 ０.６ ｍｏｌＬ 的甘露醇轻轻冲洗管壁 ２
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龄、溶壁酶浓度、稳渗剂种类、酶解温度和时间共 ５ 次ꎬ去除多余酶解液ꎬ加入 １ ｍＬ 的 ０.６ ｍｏｌＬ 甘
个关键影响因子进行研究ꎮ 以期明确两株不同温 露醇以悬浮沉淀ꎬ制成原生质体原液ꎮ
型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件及差异ꎬ针 １.２.２ 原生质体再生 用 ０.６ ｍｏｌＬ 的稳渗剂ꎬ将
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对性提高巨大侧耳原生质体制备效率ꎮ 本研究结 原生质体原液稀释不同倍数ꎬ并在血球计数板下
果可为进一步开展巨大侧耳的杂交育种、全基因 计数ꎮ 分别吸取 ２００ μＬ 各稀释倍数的原生质体
组测序和品种改良等奠定良好基础ꎬ进而有效推 溶液ꎬ均匀涂布到再生培养基上ꎬ无菌水稀释的原

动巨大侧耳遗传育种工作的深入开展ꎮ 生质体作对照ꎮ 将实验组和对照组均置于 ２６ ℃
恒温暗培养ꎬ每天观察菌落再生情况ꎮ
１ 材料与方法 １.２.３ 单因素实验 分别设置菌龄( ３、５、７、９、１１

ｄ)、 溶 壁 酶 浓 度 ( １. ０％、 １. ５％、 ２. ０％、 ２. ５％、
１.１ 材料 ３.０％)、稳渗剂种类( 甘露醇、山梨醇、蔗糖、硫酸
两株不同温型的巨大侧耳菌株ꎬ分别为高温 镁、氯化钾)、酶解温度(２５、２７、３０、３２、３５、３８ ℃ )
型菌株 ＰＧ４６ 和中温型菌株 ＰＧ７９(表 １)ꎮ 菌种现 和酶解时间(２、３、４、５、６ ｈ) 共 ５ 个处理因素( 崔玮
保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究 洁等ꎬ２０１９ꎻ苏文英等ꎬ２０２０)ꎬ每个实验设置 ５ 次
所菌种保藏中心ꎮ 重复ꎬ统计各因素对不同温型巨大侧耳菌株原生
质体产量的影响ꎮ
表 １ 两株巨大侧耳菌株的信息
１.２.４ 正交试验 在单因素实验基础上ꎬ分别选取
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ
菌龄、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间为考察因
出菇温度 素ꎬ以原生质体产量为响应值ꎬ组成 ４ 因素 ３ 水平
菌株 来源 类型 Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＩＴＳ 序列号
Ｓｔｒａｉｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｙｐｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ＩＴＳ ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ. 的正交试验( 表 ２)ꎬ以确定巨大侧耳原生质体制
(℃ )
备的最适条件ꎮ
ＰＧ４６ 海南省 栽培 ２８ ~ ３０ ＮＭＤＣＮ０００１７５Ｍ
Ｈａｉｎａｎ Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
表 ２ 正交试验设计因素与水平
ＰＧ７９ 海南省 栽培 ２２ ~ ２４ ＮＭＤＣＮ０００１７５Ｌ
Ｔａｂｌｅ ２ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
Ｈａｉｎａｎ Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ
水平
ＭＹＧ 液体培养基:麦芽糖 １０ ｇꎬ葡萄糖 ５ ｇꎬ酵 因素 编码 Ｌｅｖｅｌ
Ｆａｃｔｏｒ Ｃｏｄｅ
母浸粉 ５ ｇꎬ加水混匀后ꎬ定容至 １ Ｌꎮ １ ２ ３
再生培养基:麦芽糖 １０ ｇꎬ葡萄糖 ５ ｇꎬ酵母浸
菌龄 Ａ ５ ７ ９
粉 ５ ｇꎬ琼脂 ２０ ｇꎬ０.６ ｍｏｌＬ 甘露醇ꎬ加水混匀 Ｍｙｃｅｌｉａｌ ａｇｅ (ｄ)
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溶壁酶浓度 Ｂ ２.０ ２.５ ３.０
后ꎬ定容至 １ Ｌꎮ
Ｌｙｗａｌｌｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (％)
１.２ 方法 酶解温度 Ｃ ３０ ３２ ３５
１.２.１ 原 生 质 体 制 备 将 活 化 好 的 菌 丝 体 接 入 Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (℃ )
酶解时间 Ｄ ３ ４ ５
ＭＹＧ 液体培养基中ꎬ于转速 １５０ ｒｍｉｎ 、２６ ℃ 恒 Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｄｕｒａｔｉｏｎ (ｈ)
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温暗培养 ７ ｄꎮ 无菌条件下ꎬ过滤菌丝体ꎬ并先后
用无菌水和稳渗剂(０.６ ｍｏｌＬ 的甘露醇)各冲洗
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２ 次ꎮ 将菌丝体置于滤纸上吸干ꎬ并称取 ３００ ｍｇ ２ 结果与分析
左右放入 １.５ ｍＬ 离心管中ꎬ加入 ３ 倍体积的 ２.０％
浓度的溶壁 酶 溶 液 ( ０. ０２ ｇ 溶 壁 酶ꎬ１ ｍＬ 的 ０. ６ ２.１ 原生质体的释放
ｍｏｌＬ 甘露醇)ꎮ 轻搅混匀后放入 ３０ ℃ 的恒温 将两菌株的菌丝体置于溶壁酶溶液中ꎬ在适
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金属浴中ꎬ酶解 ４ ｈ 得到原生质体粗提液ꎮ 用无菌 宜温度下进行酶解ꎮ 每隔半小时取一次样ꎬ置于