Page 147 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期                         骈永茹等: 巨大侧耳原生质体制备条件的优化                                         １ ３ １ ５

                 由于原生质体失去了细胞壁ꎬ对外界环境十                           体稳定性下降ꎬ由于酶的作用及渗透作用ꎬ酶解时
            分敏感ꎬ稳渗剂可保持原生质体内外的压力平衡ꎬ                             间过长会导致原生质体破裂ꎮ 并且原生质体再生
            避免其破裂或皱缩 ( Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２)ꎮ 同              时需要一定量的细胞壁酶解残余物ꎬ酶解时间过
            时ꎬ稳渗剂在细胞与溶壁酶的反应中起媒介作用ꎬ                             长会导致酶解残余物过少甚至消失( 郭成金和赵
            其性质影响溶壁酶的反应活性ꎬ因此稳渗剂的选                              润ꎬ２００９)ꎮ 王昱等(２０１３) 研究也发现ꎬ酶解时间
            择非常重要(刘玉霞等ꎬ２００９)ꎮ 本研究中ꎬ以甘露                         过长ꎬ较早释放出的原生质体无细胞壁保护而破
            醇、山梨醇和蔗糖为稳渗剂时原生质体产量均较                              裂ꎬ其活性下降难于再生ꎮ 因此ꎬ适宜的酶解时间
            高ꎬ且显著高于硫酸镁和氯化钾ꎮ 前人研究也发                             尤为重要ꎮ
            现ꎬ有机糖醇稳渗剂和无机盐稳渗剂在食用菌原                                  综上所述ꎬ两株不同温型巨大侧耳菌株的原
            生质体制备中影响差异很大( 邹彰毅等ꎬ２０２０ꎻ孙                          生质体制备的最适条件相同ꎬ但各因素对两菌株
            佳星等ꎬ２０２２)ꎮ 产生这一结果可能是因为有机糖                          原生质体产量的影响不同ꎮ 因此ꎬ在制备巨大侧
            醇不仅能维持渗透压平衡ꎬ还能促进酶与底物的                              耳不同菌株的原生质体时ꎬ应按照各菌株情况和
            结合ꎬ进而 提 高 了 酶 促 反 应 的 产 量 ( 谭 文 辉 等ꎬ               实验需求进行适当调整ꎮ 本研究结果可为后续的
            ２００６)ꎮ                                             巨大侧耳杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工
                 溶壁酶是裂解细胞壁ꎬ获得原生质体的关键ꎬ                          作奠定基础ꎬ有利于推动巨大侧耳产业的发展ꎮ
            酶的类型和浓度可以影响原生质体的活力和数量
            (Ｋａｎｃｈａｎａｐｏｏｍ ＆ Ｊａｎｔａｒｏꎬ ２００１)ꎮ 李光环(２０１８)
            研究发现ꎬ单一的溶壁酶适合多种食用菌的原生                              参考文献:
            质体制备ꎬ在保证较高效率的同时成本也较低ꎮ
                                                               ＣＵＩ ＷＪꎬ ＺＨＡＯ ＹＤꎬ ＳＯＮＧ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９. Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
            但由于不同真菌的细胞壁组成和结构不同ꎬ不同                                ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ｃｏｒｎｅａ (Ｙｕｍｕｅｒ) ａｎｄ
            浓度的溶壁酶的酶解效果也会有所差异ꎮ 本研究                               ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ [ Ｊ]. Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ
            结果表明ꎬ在一定范围内ꎬ溶壁酶浓度越高ꎬ原生                               Ｂｒｅｅｄꎬ １７(１８): ６００６－６０１２. [崔玮洁ꎬ 赵一橦ꎬ 宋冰ꎬ 等ꎬ
                                                                 ２０１９. 玉木耳原生质体制备条件的优化及再生菌株的变
            质体产量越高ꎬ但浓度超过 ２.５％ 后ꎬ原生质体产
                                                                 异检测 [Ｊ]. 分子植物育种ꎬ １７(１８): ６００６－６０１２.]
            量开始下降ꎮ 这可能是因为酶浓度过高会对原生
                                                               ＤＡＩ ＹＴꎬ ＳＵ ＷＹꎬ ＹＡＮＧ ＣＴꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
            质体的膜造成影响ꎬ使得细胞脱壁太彻底ꎬ后期也                               ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｂａｉｌｉｎｇｇｕ (Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ
            会影响原生质体的再生(孙剑秋和周东波ꎬ２００２)ꎮ                            ｔｕｏｌｉｅｎｓｉｓ) ｆｏｒ ｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄｉｎｇ [Ｊ]. Ｇｅｎｅｓꎬ ８(１１): ３２５.
                                                               ＤＡＩ ＹＴꎬ ＳＵＮ Ｌꎬ ＹＩＮ ＸＬꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９. Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ
                 在相同的溶壁酶浓度下ꎬ酶解温度和酶解时
                                                                 ｇｅｎｏｍｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｇｏｂｉ ｄｅｓｅｒｔ
            间是影响破壁效果的关键ꎮ 根据酶反应的动力学
                                                                 ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ [Ｊ]. Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ １０: ２０２４.
            原理ꎬ酶解温度直接影响酶促反应的速度ꎬ还会影                             ＤＯＮＧ ＨＸꎬ ＣＡＩ ＤＨꎬ ＬＩ Ｙꎬ ２０１０. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅｓ ｏｆ
            响细胞壁的生理状态ꎬ适宜的酶解温度有助于溶                                ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｅｓ ｉｎ Ｐａｎｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ [ Ｊ ]. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｃｈｉｎꎬ
            壁酶发挥最佳的裂解作用ꎮ 本研究中ꎬ３２ ℃ 为两                            ３７(１１): １６１７－１６２０. [董洪新ꎬ 蔡德华ꎬ 李玉ꎬ ２０１０. 猪肚
                                                                 菇担孢子交配型的分析 [Ｊ]. 微生物学通报ꎬ ３７(１１):
            菌株的最适酶解温度ꎬ低于该温度时需适当延长
                                                                 １６１７－１６２０.]
            酶解时间来获得较高的原生质体产量ꎬ高于该温
                                                               ＧＵＯ ＣＪꎬ ＺＨＡＯ Ｒꎬ ２００９. Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
            度时原生质体产量下降且再生率也降低ꎮ 一方                                ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ [ Ｊ]. Ｆｏｏｄ Ｓｃｉꎬ ３０ (５):
            面ꎬ可能是因为温度过低时ꎬ酶活力不足ꎬ且菌丝                               １６６－１７０. [郭成金ꎬ 赵润ꎬ ２００９. 冬虫夏草原生质体制备
            生理代谢慢ꎬ导致酶解反应较慢ꎻ温度过高ꎬ会破                               与再生条件的研究 [Ｊ]. 食品科学ꎬ ３０(５): １６６－１７０.]
                                                               ＨＥ Ｔꎬ ＧＵＯ ＣＪꎬ ２０１２. Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
            坏酶的稳定性ꎬ降低溶壁酶活性和损伤已游离的
                                                                 ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｒｅｍｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｌｂａ [Ｊ]. Ｊ Ａｎｈｕｉ
            原生质体ꎬ进一步影响细胞再生率( 张丽霞和郭成                              Ａｇｒｉｃ Ｓｃｉꎬ ４０(３): １３７４－１３７６. [贺婷ꎬ 郭成金ꎬ ２０１２. 金
            金ꎬ２００８ꎻ贺婷和郭成金ꎬ２０１２)ꎮ 另一方面ꎬ酶解                         耳原生质体制备与再生研究 [Ｊ]. 安徽农业科学ꎬ ４０(３):
            时间可以影响酶促反应的程度ꎬ适当延长酶解时                                １３７４－１３７６.]
                                                               ＫＡＮＣＨＡＮＡＰＯＯＭ Ｋꎬ ＪＡＮＴＡＲＯ Ｓꎬ ２００１. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ
            间可获得较高的原生质体释放量ꎮ 本研究中ꎬ两
                                                                 ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｐｏｍｐａｄｏｕｒ
            菌株的最适酶解时间均为 ４ ｈꎬ超过 ４ ｈ 原生质体
                                                                 [Ｊ]. Ｓｃｉｅｎｃｅａｓｉａꎬ ２７(１): ２９－３４.
            产量开始下降ꎮ 推测是因为失去细胞壁的原生质                             ＫＡＲＵＮＡＲＡＴＨＮＡ ＳＣꎬ ＹＡＮＧ ＺＬꎬ ＫＯ ＴＷＫꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ
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