Page 155 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 彭欢等: 罗汉果品质受气候因子影响及其分子调控机制 １ ３ ５ ５

司ꎮ ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、 １０ × Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ 体系逆转 录 程 序 ( 于 ＰＥ 管 中 先 加 入 ４ × ｇＤＮＡ
Ｂｕｆｆｅｒ、Ｒ２３２ 反转录试剂盒、Ｑ７１１ 荧光定量试剂盒 ｗｉｐｅｒ Ｍｉｘ ４ μＬꎬ再加入 １ μｇ 模板 ＲＮＡ)ꎻ然后ꎬ加
购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司ꎮ 引物由 ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ ｄｄＨ Ｏ 至 １６ μＬꎬ用移液枪吹打混匀后
２
生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ 分析纯 置于 ＰＣＲ 仪中 ４２ ℃ 反应 ２ ｍｉｎꎻ接着ꎬ向反应液中
三氯甲烷和无水乙醇、琼脂糖购于广西福兰德生 加入 ５ × Ｈｉ Ｓｃｒｉｐｔ Ⅲ ｑＲＴ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ ４ μＬ 使体积达

物科技有限公司ꎮ 到 ２０ μＬꎬ用移液枪吹打混匀后继续于 ＰＣＲ 仪中
１.３ 方法 ３７ ℃ 反应 １５ ｍｉｎ、８５ ℃ 反应 ５ ｓꎻ最后ꎬ以逆转录
１.３.１ 试验设计 盛花期随机选取发育一致雌花 ｃＤＮＡ 为模板ꎬＳｇＵＢＱ 为内参基因ꎬ利用表 １ 所列
３００ 朵授粉并挂牌标记日期ꎬ２０２２ 年 ７ 月 １６ 日授粉 各基因特异性引物ꎬ采用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 法测定 ５５ ｄ 夏
并挂牌标记的为夏季授粉果实ꎬ８ 月 １９ 日授粉并挂 季和秋季授粉果实罗汉果苷合成酶基因表达水
牌标记的为秋季授粉果实ꎮ 于授粉当天(０ ｄ) 及授 平ꎮ 反应体系:ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ １０ μＬꎬ正反向引物
粉后 ５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５ ｄ 随机采样 各 １ μＬꎬ模板 ２ μＬꎬ加 ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ ｄｄＨ Ｏ 至 １０ μＬꎮ
２
测定果实的横径、纵径及单果重ꎬ每个时期重复测 反应程序:９５ ℃ 预变性 ３０ ｓꎬ９５ ℃ 变性 １０ ｓ、６０ ℃
定 １０ 个果实ꎮ 同时ꎬ于授粉后 ５、３５、５５、７５、８５、９５ 退火及延伸 ３０ ｓ 共 ４０ 循环ꎮ 熔解曲线程序:９５ ℃
ｄꎬ分别随机采集发育良好的夏季和秋季授粉果实 ３ １５ ｓꎬ６０ ℃ ６０ ｓꎬ９５ ℃ １５ ｓꎬ３７ ℃ ３０ ｓꎮ
个剥取果肉ꎬ用标记好的锡箔纸收集后液氮中冷冻 １.４ 数据统计
３０ ｍｉｎꎬ放入－８０ ℃冰箱保存ꎬ用于罗汉果苷含量测 试验所得数据采用 Ｅｘｃｅｌ ２０１６ 进行整理和统
定ꎬ每个样品 ３ 个生物学重复ꎮ 此外ꎬ于授粉后 ５５ ｄ 计分析ꎮ 按 ０ ~ ５ ｄ、５ ~ １５ ｄ、１５ ~ ２５ ｄ、２５ ~ ３５ ｄ、
这一罗汉果苷 Ｖ 快速积累期ꎬ分别随机采集当天 ３５ ~ ４５ ｄ、４５ ~ ５５ ｄ、５５ ~ ６５ ｄ、６５ ~ ７５ ｄ、７５ ~ ８５ ｄ 时
１４:００、１８:００、２:００、６:００ 和 ９:００ 发育良好的夏季 间段ꎬ平均温度、光照强度、空气湿度为所有记录
和秋季授粉果实 ３ 个ꎬ同罗汉果苷含量测定采样方 温度的平均值ꎬ有效积温为 １５ ℃ 以上平均温度减
法采集保存果肉样品ꎬ用于罗汉果苷 Ｖ 合成酶基因 去 １５ ℃ 差的总和ꎬ昼夜温差为白天平均温度与夜
表达水平 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析ꎮ 晚平均温度之差ꎮ 各个时间点罗果苷 Ｖ 合成酶基
１.３.２ 指标测定 因的相对表达量用 ２ －ΔΔＣｔ 法计算ꎮ 夏季和秋季授
１.３.２.１ 环境因子监测 授粉挂牌前ꎬ于试验田中 粉果实横径、纵径、单果重、罗汉果苷 Ｖ 及其前体
部ꎬ在罗汉果种植棚上方 ２０ ｃｍ 处放置温湿度计和 与衍生物质含量差异ꎬ以及 １４:００ 与其余时间点
温度光照计ꎬ设置每隔 ３０ ｍｉｎ 记录 １ 次温度、空气 间各罗汉果苷 Ｖ 合成酶基因表达量差异显著性分
湿度和光照强度数据ꎮ 析采用 ｔ￣检验ꎮ
１.３.２.２ 果实大小测量 横径用数显电子游标卡尺
测量果实中部最大处ꎬ纵径用数显电子游标卡尺测 ２ 结果与分析
量果柄到果脐间的距离ꎬ单果重采用精度为 ０.０１ ｇ
的电子天平称量单个果实重量ꎬ并进行数据记录ꎮ ２.１ 果实生境气候因子比较
１.３.２.３ 罗汉果苷含量测定 于－８０ ℃ 超低温冰箱 由图 １ 和图 ２ 可知ꎬ夏季授粉果实平均温度基
中取出果肉样品保存于液氮中后ꎬ放入到液氮预 本稳定不变ꎬ为 ２７.７９ ℃ 左右ꎬ有效积温除 ０ ~ ５ ｄ

冷研钵ꎬ在液氮中迅速研磨成均匀粉末ꎬ按照 Ｑｉａｏ 较低外也基本稳定不变ꎬ约为 １１８.５０ ℃ ꎬ秋季授粉
等(２０１９) 的 ＨＰＬＣ ＭＳ / ＭＳ 方法提取并测定罗汉 果实平 均 温 度 和 有 效 积 温 则 变 化 较 大ꎬ 分 别 在

果苷 ＩＡ、罗汉果苷 ＩＥ、罗汉果苷ⅡＥ、罗汉果苷Ⅲ、 １５ ~ ２８ ℃ 之间和 １８ ~ １３０ ℃ 之间ꎬ都基本低于夏季
罗汉果苷ⅢＥ、罗汉果苷ⅣＡ、罗汉果赛门苷 Ｉ、罗汉 授粉果实ꎮ 但是ꎬ两者果实生境平均温度和有效

果苷Ⅴ、１１￣Ｏ￣罗汉果苷 Ｖ 的含量ꎮ 积温 ３５ ｄ 以前相近ꎬ３５ ｄ 以后秋季授粉果实明显
１.３.２.４ 罗汉果苷合成酶基因表达分析 首先ꎬ采 低于夏季授粉果实ꎬ分别下降为 ２０ ℃ 和 ６０ ℃ 左
用 ＣＷ０５８１Ｍ 超纯 ＲＮＡ 提取试剂盒提取 ５５ ｄ 夏季 右ꎬ７６ ~ ８５ ｄ 进一步下降至 １６.８０ ℃ 和 １８.０３ ℃ ꎮ
和秋季授粉果实总 ＲＮＡꎻ其次ꎬ利用 Ｒ２３２ 试剂盒 由图 １ 可知ꎬ夏季授粉果实 ０ ~ ５ ｄ 较低ꎬ为
通过两步法将总 ＲＮＡ 逆转录为 ｃＤＮＡꎬ２０ μＬ 反应 ３.７５ ℃ ꎻ６ ~ ４５ ｄ 较稳定ꎬ约为 ９.４３ ℃ ꎻ４６ ~ ７５ ｄ 则