Page 128 - 《广西植物》2020年第6期

８ ７ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
ａｃｉｄｓꎻ ＣｓＰＬＫ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＰＬＫ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙꎬ ｂｏｔｈ ｗｅｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂｏｋｉｎａｓｅ ｓｕｐｅｒ￣
ｆａｍｉｌｙꎻ Ｔｈｅ ｐＥＴ￣ＣｓＰＬＫ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｏ
ｈａｖｅ ｓｔｒｏｎｇ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｔｒｅｅ ｉｓ ＰＬ ｋｉｎａｓｅꎻ Ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｒｏｏｔｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｉｎ ｒｏｏｔｓꎻ Ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣｓＰＬＫ ｗａｓ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ＣｓＰＬＫ ｗａｓ ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ
ｄｒｏｕｇｈｔ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ＣｓＰＬＫ ｈａｄ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｔｅａ ｐｌａｎｔｓꎬ ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＣｓＰＬＫ ｐｌａｙｅｄ ａｎ ｉｍ￣
ｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｅａ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｔｅａ ｐｌａｎｔꎬ ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓꎬ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ

维生素 Ｂ (ＶＢ )是一类可以相互转换的吡啶 有报道ꎮ 因此ꎬ研究茶树中 ＶＢ 补救途径中的 ＰＬ
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类化合物的总称ꎬ包括吡哆醇( ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅꎬＰＮ)、吡 激酶在茶树生长发育和逆境调控中的作用具有重

哆胺(ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅꎬＰＭ)、吡哆醛(ｐｙｒｉｄｏｘａｌꎬＰＬ) 以 要意义ꎮ 本研究以茶树龙井 ４３ 的 ｃＤＮＡ 为模板克
及 它 们 相 应 的 磷 酸 酯 形 式: 磷 酸 吡 哆 醇 隆出 ＰＬ 激酶基因ꎬ通过原核表达进行功能验证ꎬ
(Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ￣５’￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＰＮＰ)、磷酸吡哆胺(Ｐｙｒｉ￣ 并分析不同组织中的基因表达差异ꎬ同时设置干
ｄｏｘａｍｉｎｅ￣５’￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＰＭＰ) 和磷酸吡哆醛( Ｐｙｒｉ￣ 旱和低 温 胁 迫 分 析 ＣｓＰＬＫ 的 逆 境 应 答ꎬ 为 利 用
ｄｏｘａｌ￣５’￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＰＬＰ)ꎮ 其中 ＰＬＰ 是 １４０ 多种 ＶＢ 代谢调控提高茶叶品质和增强茶树抗性的研
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酶的辅酶ꎬ涉及广泛的代谢和调节过程(Ｓｃｈｕｌｍａｎ ＆ 究奠定基础ꎮ
Ｒｉｃｈｅｒｔꎬ１９５７ꎻ Ｓｍｏｌｉｎ ＆ Ｂｅｎｅｖｅｎｇａꎬ １９８２ꎻ Ａｍａｄａｓｉ
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７)ꎮ 植物是 ＶＢ 自养型生物ꎬ拥有“ＤＸＰ １ 材料与方法
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非依赖途径” ( ＤＸＰ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ)ꎬ以谷氨
酰胺、５￣磷酸￣核糖( 或 ５￣磷酸￣核酮糖) 和 ３￣磷酸￣ １.１ 茶树 ＣｓＰＬＫ 的克隆与分析
甘油醛 ( 或 磷 酸 二 羟 丙 酮) 为 底 物ꎬ 在 ＰＤＸ１ 和 所用材料为龙井 ４３ 茶树幼苗ꎬ种植于安徽农
ＰＤＸ２ 构成的 ＰＬＰ 合酶复合体的作用下ꎬ直接从头 业大学茶与食品科技学院实验分析平台ꎮ

合 成 ( ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ) ＰＬＰ ( Ｊｕｌｌｉａｒｄ ＆ Ｄｏｕｃｅꎬ 使用全能型植物 ＲＮＡ 提取试剂盒 ( 康维世
１９９１ꎻＦｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００１)ꎮ 除了 ＶＢ 的从头合成ꎬ 纪)ꎬ提取茶树叶片、根和茎的总 ＲＮＡꎬ用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ
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植物体内还存在 ＶＢ 补救途径( ｓａｌｖａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ) ＮＤ １ ０００检测 ＲＮＡ 的浓度与纯度ꎬ１.０％凝胶电泳检
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(Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５)ꎬ该途径通过一系列酶的作 测 ＲＮＡ 质量ꎮ 用 ＨｉｆｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ 合成试剂盒(康维
用ꎬ实现不同 ＶＢ 的相互转化和 ＰＬＰ 的补救合成ꎬ 世纪)对上述总 ＲＮＡ 样本进行反转录获得 ｃＤＮＡꎮ
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以及维持 ＶＢ 状态的稳定ꎮ ＰＬ 激酶( ＰＬ ｋｉｎａｓｅꎬ 以拟南芥 ＰＬＫ 序列为模板ꎬ从中国科学院昆明
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ＰＬＫ)是 ＰＬＰ 的补救合成途径重要的一种酶ꎬＰＬＫ 植物研究所茶树基因组数据库中ꎬ通过比对获得候
在金属阳离子和 ＡＴＰ 的存在下催化 ＰＬ 的磷酸化 选序列并设计特异性引物ꎬ由安徽通用生物公司合

生成 ＰＬＰꎮ 科研人员陆续从拟南芥( Ｌｕｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ 成ꎮ 上游引物:ｇＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＡꎻ
２００２)、小 麦 ( Ｈｕａｂｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４) 和 油 菜 ( Ｙｕ ＆ 下游引物:ｇｃＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣꎮ 下
Ｌｕｏꎬ２０１０)克隆出 ＰＬ 激酶基因ꎬ开启了从植物中 划线部分为 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｘｂａ Ｉ 酶切位点ꎮ

研究 ＰＬＫ 基因的热潮ꎮ 以上述 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ建立扩增体系:Ｐｒｉｍｅｒ
茶树(Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ) 是我国重要的经济作 Ｓｔａｒ ＭＩＸ 酶 ( ＴａＫａＲａ 公 司) １２. ５ μＬ、 ｄｄＨ Ｏ ９. ５
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物ꎬ富含茶氨酸、儿茶素和咖啡碱等重要功能成 μＬ、ｃＤＮＡ 模板 １ μＬ 、上下游引物各 １ μＬꎮ 扩增

分ꎮ ＶＢ 不仅在茶树的初生代谢和功能成分的生
６ 条件:９８ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ９８ ℃ １０ ｓꎬ５５ ℃ １５ ｓꎬ７２
物合成过程中发挥重要作用ꎬ同时 ＶＢ 在植物体内 ℃ ９０ ｓꎬ共 ３５ 个循环ꎻ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎮ 反应结束后
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参与逆境应答ꎬ但目前关于茶树中 ＶＢ 生物合成鲜 用 １％琼脂糖凝胶电泳检验 ＰＣＲ 产物ꎬ分离回收正
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