Page 133 - 《广西植物》2020年第6期

６ 期 陈星星等: 茶树 ＣｓＰＬＫ 基因的鉴定与表达分析 ８ ７ ９

性达 到 ７０％ 以 上ꎬ 有 很 强 的 亲 缘 性ꎮ ＣｓＰＬＫ 的
Ａｓｐ１５１、 Ｔｙｒ１６１、 Ｇｌｙ３１３ 和 阴 离 子 孔 基 序 ＧＴＧＤ
(Ｇｌｙ３１３￣Ａｓｐ３１７１)与已经证实的 ＰＬＫ 的 ＡＴＰ 结合
位点完全一致ꎬ这几个氨基酸残基高度保守ꎬ三个

ＡＴＰ 磷酸基团通过由高度保守的序列基序 ＧＴＧＤ
和附近螺旋 Ｎ 末端形成的阴离子孔以及结合需要

的金属阳离子ꎬ促进氢键与蛋白质残基互相作用ꎬ
使 ＰＬＫ 活 性 位 点 的 空 间 结 构 更 稳 定ꎬ 从 而 提 高
ＰＬＫ 活性( Ｋｉｍ ＆ Ｈｏｎｇꎬ２０１６)ꎮ 科研人员分别对
牛(Ｎｅａｒｙ ＆ Ｄｉｖｅｎꎬ１９７０)、猪( Ｇａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９８)、
图 １０ 金属离子对 ＣｓＰＬＫ 活性的影响
羊 ( Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９９ ) 和 拟 南 芥 ( Ｌｕｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ
Ｆｉｇ. １０ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ｏｎ ＣｓＰＬＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２００２)的 ＰＬＫ 进行酶动力学研究时ꎬ得出 Ｚｎ 是
２＋
ＰＬＫ 发挥活性作用的最适金属离子ꎬ本研究通过
对不同的二价金属离子测定酶活性ꎬ发现活化效
２＋ ２＋ ２＋ ２＋ ２＋
率依次是 Ｚｎ > Ｃｏ >Ｍｎ > Ｍｇ > Ｃａ ꎬ得出 ＰＬ
激酶在 Ｚｎ 存在下的催化活性最强ꎬ与前人结论
２＋
一致ꎮ ＣｓＰＬＫ 的 Ｓｅｒ ６８、Ｔｈｒ １０３、Ｔｙｒ１４３ 和 Ａｓｐ３１７
与已经验证的与 ＰＬ 形成氢键相互作用的氨基酸
残基一致ꎬ这些氨基酸残基也高度保守ꎬ决定底物
特异性( Ｓｃｈｏｌｚ ＆ Ｋｗｏｋꎬ １９８９)ꎮ 茶树中的 ＣｓＰＬＫ
和其他物种 ＰＬＫ 一样具有高度保守的与功能密切
相关的 ｌｏｏｐＩ 和 ｌｏｏｐⅡ结构ꎬＣｓＰＬＫ 的 ｌｏｏｐＩ 结构为

图 １１ 茶树各组织中 ＣｓＰＬＫ 基因的表达 Ｇｌｙ１５５￣Ｖａｌ１６２ꎬ与大多数植物和微生物长度一致ꎬ
Ｆｉｇ. １１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣｓＰＬＫ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｅａ ｔｉｓｓｕｅｓ 为 ８ 个氨基酸ꎬ而高等动物为 １２ 个氨基酸ꎬｌｏｏｐＩ
对防止 ＡＴＰ 无效的水解ꎬ以及在保护和促进底物

ＰＬＫ 表达量下降ꎬ第 １２ 天时表达量降到最低ꎬ复 结合方面有重要作用ꎬ至于不同物种中 ｌｏｏｐＩ 的氨
水后第 ６ 天表达量上升ꎬ且高于干旱处理前水平 基酸不同ꎬ是否与生物进化有关目前尚不清楚ꎬ需
(图 １２:ｂ)ꎮ 这表明 ＣｓＰＬＫ 参与茶树对低温和干 要进一步的实验研究ꎻＣｓＰＬＫ 的 ｌｏｏｐⅡ区域在植物
旱胁迫的响应ꎬ但其在两种胁迫下表达模式不同ꎮ 中高度保守ꎬ与酶的底物特异性和底物亲和力有
关(Ｃａｍｐｏｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０００ꎻＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２)ꎮ
３ 讨论与结论 本研究通过构建原核表达载体以及体外酶活
测定ꎬ得出茶树中的 ＣｓＰＬＫ 在 ｐＨ 为 ６.４ 和金属阳
２＋
本研究利用已知的拟南芥 ＰＬＫ 的基因序列为 离子为 Ｚｎ 时有很强的催化活性ꎬ催化 ＰＬ 的磷酸
模板ꎬ在茶树基因组数据库中比对得到一条相似 化生成 ＰＬＰꎬ表明原核表达产物为 ＣｓＰＬＫ 蛋白ꎮ
性最高(５７.８６％)的为候选茶树 ＰＬＫ 序列ꎬ其编码 通过对茶树体内 ＣｓＰＬＫ 的组织差异性分析ꎬ发现
的氨基酸序列含有一个典型的吡哆醛激酶功能 在茶树的叶、茎、根中均有表达ꎬ并且在叶片中表
域ꎬ属于核糖激酶超家族的成员ꎮ 利用 ＰＣＲ 技术 达量最高ꎬ推测可能与叶片中含有丰富的叶绿体
从茶 树 龙 井 ４３ 中 克 隆 出 ＰＬＫ 基 因ꎬ 命 名 为 有关ꎮ 植物有 ＶＢ 的从头合成途径ꎬ 利用 ＤＸＰ 非
６
ＣｓＰＬＫꎮ 多序列的同源比对结果表明ꎬＣｓＰＬＫ 与拟 依赖途径直接合成 ＰＬＰ 从而被细胞利用ꎬ合成的
南芥、烟草、大豆等植物中的 ＰＬＫ 氨基酸序列相似 场所是细胞质ꎬ 叶绿体中可能是通过 ＰＬＰ 的补救