Page 131 - 《广西植物》2020年第6期

６ 期 陈星星等: 茶树 ＣｓＰＬＫ 基因的鉴定与表达分析 ８ ７ ７

油菜 ( Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ)、 大 豆 ( Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ)、 烟 草
(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ)、小麦( Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ) 和玉
米( Ｚｅａ ｍａｙｓ) ＰＬＫ 的 一 致 性 分 别 为 ７７. ３９％、
７９.７１％、７６.２３％、８２.９５％、７１.３０％和 ７１.５９％ꎬ有很

高的亲缘性ꎮ
２.３ ＣｓＰＬＫ 基因原核表达载体构建
使用 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｘｂａ Ｉ 限制性内切酶对含有目

的基因的 ｐＰＬＫ 载体和 ｐＥＴ￣２２ｂ( ＋)载体进行双酶
切(图 ５)ꎮ 使用 Ｔ４ 连接酶 １６ ℃ 连接目的基因与
载体片段ꎬ转化至 Ｔｒａｎｓ Ｔ１ 大肠杆菌中ꎬ涂板过夜
培养ꎬ进行菌落 ＰＣＲ 验证ꎬ可以看出目的基因成功

连接至 ｐＥＴ￣２２ｂ( ＋)载体上(图 ６)ꎮ
图 ３ ＣｓＰＬＫ 在原核表达中的图谱 ２.４ ＣｓＰＬＫ 蛋白的诱导表达
Ｆｉｇ. ３ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣｓＰＬＫ 采 用 Ｔ ７ 启 动 子 / Ｔ ７ ＲＮＡ 聚 合 酶 表 达 系 统

茶树 ＰＬＫ、拟南芥 ＰＬＫ(２６３９７６９４)、 油菜 ＰＬＫ(９２１１１３５１)、大豆 ＰＬＫ(６８１３１８１７)、烟草 ＰＬＫ(８５０６８６０９)、小麦 ＰＬＫ(３０４５６１３１０)、
玉米 ＰＬＫ(２２６５０２９３４)ꎮ 图中☆、◇表示两种不同的活性位点ꎻ红色划线部分为 ｌｏｏｐＩ、ｌｏｏｐⅡꎻ黄色方框是 ＧＴＧＤ 基序ꎮ
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＰＬＫꎬ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＬＫ(２６３９７６９４)ꎬ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＰＬＫ(９２１１１３５１)ꎬ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＰＬＫ(６８１３１８１７)ꎬ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ ＰＬＫ(８５０６８６０９)ꎬ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ＰＬＫ(３０４５６１３１０)ꎬ Ｚｅａ ｍａｙｓ ＰＬＫ(２２６５０２９３４). ☆ ａｎｄ ◇ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓꎻ
Ｒｅｄ ｌｉｎｅ ｐａｒｔ ａｒｅ ｌｏｏｐＩꎬ ｌｏｏｐⅡꎻ Ｙｅｌｌｏｗ ｂｏｘ ｉｓ ｔｈｅ ＧＴＧＤ ｍｏｔｉｆ.
图 ４ 茶树与其他物种中 ＰＬＫ 多序列比对
Ｆｉｇ. ４ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＰＬＫ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｅａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ

ｐＥＴ￣２２ｂ( ＋) ￣Ｒｏｓｅｔｔａ( ＤＥ３) 对 ＣｓＰＬＫ 在大肠杆菌 ２.５ ＣｓＰＬＫ 的酶活测定及部分酶学性质分析
中进行蛋白表达ꎮ 在 ＩＰＴＧ 的诱导下ꎬ插入 Ｔ７ 启 以 ＰＬ 为底物ꎬ在 ｐＨ ６.５ 和 ３７ ℃ 条件下ꎬ对原

动子后的编码区能够在表达菌株 Ｒｏｓｅｔｔａ( ＤＥ３) 核表达的重组茶树 ＰＬ 激酶进行功能鉴定ꎮ 图 ８
中被高 效 转 录ꎮ 原 核 表 达 产 物 经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 凝 结 果 显 示ꎬｐｒｏ￣ＣｓＰＬＫ 的 酶 活 力 约 为 ４. ８５３ μｍｏｌ
胶电泳显示ꎬ在 ４５ ｋＤａ 附近成功诱导出了目的 ＰＬＰ ｍｇ ｍｉｎ ꎬ 对 照 组 ｐｒｏ￣２２ｂ 约 为 ０. ５２９
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蛋白ꎬ且在上清中大量表达ꎬ与预测蛋白大小一 μｍｏｌ ＰＬＰｍｇ ｍｉｎ ꎬｐｒｏ￣ＣｓＰＬＫ 酶活力是对照
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致( 图 ７) ꎮ 的 ９.１７ 倍ꎮ 这表明 ＣｓＰＬＫ 具有较强的 ＰＬ 激酶活