Page 129 - 《广西植物》2020年第6期
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６ 期 陈星星等: 茶树 ＣｓＰＬＫ 基因的鉴定与表达分析 ８ ７ ５
确的 ＰＣＲ 产物连接载体 ｐＥａｓｙ￣ｂｌｕｎｔ( 北京全式金 料ꎬ取生长在(２５±１) ℃、含水率为(５５±３)％的茶树
生物有限公司)ꎬ并转化到大肠杆菌 ＤＨ５αꎬ命名为 幼苗的的嫩根、嫩茎、顶端第 ２ 至第 ３ 片成熟叶进行
ｐＰＬＫꎬ送至通用生物公司进行测序ꎮ 组织表达差异性分析ꎮ 参照 Ｌｉｕ ( ２０１５) 和 Ｌｉｎ ｅｔ
使用 ＥｘＰＡＳｙ 网 站 的 在 线 分 析 工 具 ( ｈｔｔｐ:/ / ａｌ.(２０１６)的方法进行低温(４ ℃) 和干旱处理ꎮ 调
ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ/ ｐｉ＿ ｔｏｏｌ) 分析蛋 节人工气候室的温度使之维持在(４±１) ℃ꎬ实验组
白质的分子量和等电点ꎻ使用 ＤＮＡＭＡＮ 进行序列比 与对照组均为生长在温室(２５ ±１) ℃ 中的茶树幼
对分析ꎮ 苗ꎮ 对照组保持温室(２５±１) ℃ 生长不变ꎬ实验组
１.２ ＣｓＰＬＫ 表达载体构建和功能鉴定 中的茶苗迅速移入低温气候室(４ ℃) 中ꎬ其他环境
使用柱式质粒 ＤＮＡ 提取试剂盒( Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏ￣ 条件保持不变ꎬ进行低温处理ꎬ分别在 ２、８、１２、２４、
ｔｅｃｈ)提取转化了 ＣｓＰＬＫ 基因的 ｐＰＬＫ 菌株的质粒 ４８ ｈ 时取茶苗上枝条顶端第 ２ 至第 ３ 片成熟叶为材
和 ｐＥＴ￣２２ｂ ( ＋ ) 载 体 质 粒ꎬ 使 用 限 制 性 内 切 酶 料ꎻ将茶树幼苗放置在(２５±１) ℃ 的人工气候室中ꎬ
ＥｃｏＲ Ｉ和 Ｘｂａ Ｉ( ＴＡＫＡＲＡ) 于 ３７ ℃ 分别进行双酶 实验组与对照组土壤含水率为(５５±３)％ꎬ对照组浇
切 ３ ｈꎬ使用胶回收试剂盒(Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ) 回收双 水使土壤含水率维持在(５５±３)％ꎬ实验组停止浇
酶切之后的目的片段和载体片段ꎬ利用 Ｔ４ ＤＮＡ 连 水ꎬ其他环境条件保持一致ꎬ进行干旱处理ꎬ分别在
接酶(ＴＡＫＡＲＡ)ꎬ于 １６ ℃ 连接 １６ ｈꎬ连接产物转 ６、１２ ｄ 时取样(顶端第 ２ 至第 ３ 片成熟叶)后ꎬ给实
化到 Ｔｒａｎｓ Ｔ１ 大肠杆菌中ꎬ经菌液 ＰＣＲ 验证后送 验组浇水使其土壤含水率恢复至(５５±３)％ꎬ在恢复
至通用生物公司进行测序ꎮ ６ ｄ 时取样(顶端第 ２ 至第 ３ 片成熟叶)ꎬ用于检测
提取连接上 ＣｓＰＬＫ 基因的 ｐＥＴ￣２２ｂ( ＋) 菌株 ＣｓＰＬＫ 在干旱胁迫后复水过程的表达模式ꎮ 每个处
质粒ꎬ转化至 Ｒｏｓｅｔｔａ( ＤＥ３) ( ＴｒａｎｓＧｅｎ) 表达菌株 理进行 ３ 次生物学重复ꎮ 所有样品液氮速冻后保存
中ꎬ涂板过夜培养ꎬ挑取单菌落进行菌液 ＰＣＲ 验 于－８０ ℃ꎬ提取 ＲＮＡꎬ检测 ＣｓＰＬＫ 的表达模式ꎮ
￣１
证ꎬ选择验证正确的菌落加入 ０.２ ｍｍｏｌＬ ＩＰＴＧꎬ 采 用 荧 光 定 量 ＰＣＲ ( Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
在 １６ ℃ 诱导表达 ２４ ｈ→４ ℃ 、４ ０００ ｒｍｉｎ 离心 ＰＣＲꎬＱＲＴ￣ＰＣＲ)测定 ＣｓＰＬＫ 的表达ꎬ以 ＧＡＰＤＨ 为
￣１
１０ ｍｉｎ→弃去上清ꎬ加入 ＰＢＳ 重悬→超声波细胞 内参基因ꎮ ＣｓＰＬＫ 的上游引物为 ＡＡＧＧＴＴＧＴＣＣＣＴ￣
破碎仪ꎬ５ ｓ、３ ｓ、破碎 ９９ 次→４ ℃ 、１２ ０００ ×ｇ 离心 ＧＴＴＧꎬ下游引物为 ＴＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡꎮ ＧＡＰＤＨ
１０ ｍｉｎꎬ所得上清液即为粗酶液ꎮ 将含有重组质粒 的上游引物为 ＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＣＴꎬ下游引物
ｐＥＴ￣ＰＬＫ 的粗酶液命名为 Ｐｒｏ￣ＣｓＰＬＫꎬ含有空质粒 为 ＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＣＧＧＡＡＡＧＣꎮ
ｐＥＴ￣２２ｂ 的粗酶液命名为 Ｐｒｏ￣２２ｂꎮ 使用 ＵｌｔｒａＳＹＢＲ Ｍｉｘｔｕｒｅ 荧光定量试剂盒(康维
采用 Ｌｕｍ ｅｔ ａｌ.(２００２) 的方法ꎬ略做改动后测 世纪)进行荧光定量 ＰＣＲꎬ３０ μＬ 反应体系由 ２×ＵＬ￣
定 ＣｓＰＬＫ 酶 活 性ꎬ 反 应 体 系 ３ ｍＬꎮ 向 含 有 ０. ２ ｔｒａＳＹＢＲ １５ μＬ、正向引物 １.５ μＬ、反向引物 １.５ μＬ、
￣１ ￣１ ￣１ ｃＤＮＡ 模板 １.５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ １０.５ μＬ 构成ꎬ反应程序
ｍｍｏｌＬ ＰＬ、０.２ ｍｍｏｌＬ ＡＴＰ 和 ０.１ ｍｍｏｌＬ
２
￣１
ＺｎＣｌ 的 ７０ ｍｍｏｌＬ 磷酸钾缓冲液( ｐＨ ６.５) 中ꎬ 为 ９５ ℃ １０ ｍｉｎꎬ９５ ℃ １５ ｓꎬ５８ ℃ １ ｍｉｎꎬ９５ ℃ １５ ｓꎬ
２
加入含 ０.５ ｍｇ Ｐｒｏ￣ＣｓＰＬＫ 蛋白ꎬ３７ ℃ 水浴反应 ３０ ６０ ℃ １ ｍｉｎꎬ９５ ℃ １５ ｓꎬ６０ ℃ １５ ｓꎬ３０ 个循环ꎮ ３ 次
－ΔΔＣＴ
ｍｉｎꎮ 添加高氯酸终止反应后 １２ ０００ ×ｇ 离心 １０ 技术重复ꎬ用 ２ 法计算结果ꎮ 对照组和处理组
ｍｉｎꎬ在上清中加入苯肼溶液并定容到 ３ ｍＬꎮ ２.５ 之间的差异显著性采用 ｔ 检验进行分析:∗表示
ｍｉｎ 时在 ４１０ ｎｍ 处测定其吸光值为 Ｘꎬ同时加入 ０.０１≤Ｐ<０.０５ ꎬ∗∗表示 Ｐ<０.０１ꎮ
粗酶液和高氯酸的反应管中测定吸光值为 Ｙꎬ( Ｘ－
Ｙ)为每一组样品的最终吸光值ꎮ 以 Ｐｒｏ￣２２ｂ 代替 ２ 结果与分析
Ｐｒｏ￣ＣｓＰＬＫꎬ其余条件相同ꎬ作为空白对照ꎮ
１.３ 茶树 ＣｓＰＬＫ 表达模式分析 ２.１ 茶树 ＣｓＰＬＫ 基因的克隆
以生长健壮、长势一致的 １ 年生龙井 ４３ 为材 以拟南芥 ＰＬＫ 的基因序列( ＮＭ＿００１３４４２２２)
