Page 160 - 《广西植物》2023年第7期

１ ３ ２ ８ 广 西 植 物 ４３ 卷
蓖麻根腐病抗性鉴定的有效方法和标准ꎻ(２) 对野 发病率(％)＝ (发病株数 / 调查株数) ×１００ꎻ
生材料ꎬ尤其是中国华南野生材料的育种价值作 抗病材料比率(％) ＝ [(１ 级材料数 ＋ ２ 级材
出科学评价ꎬ筛选出一批育种急需的抗病资源ꎻ 料数) / 材料总数 ] ×１００ꎮ
(３)建立可用于辅助选择的分子标记ꎬ为蓖麻抗根 １.５ 抗病性分子标记的建立

腐病育种奠定重要基础ꎮ １.５.１ 基因组 ＤＮＡ 的提取与检测 采用改良的
ＣＴＡＢ 法 ( Ｃｕｌｌｉｎｇｓꎬ ２０１０) 提 取 基 因 组 ＤＮＡꎮ 用
１ 材料与方法 １％的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ＤＮＡ 的 完 整 性ꎬ 用
ＮａＮｏＤＲｏｐ￣２０００ 仪器检测 ＤＮＡ 的质量和浓度ꎬ统
１.１ 试验材料 一稀释至 ３０ ｎｇμＬ 后ꎬ－２０ ℃ 保存备用ꎮ
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１.１.１ 蓖麻材料 供试材料由 ３ 部分组成:一是广 １.５.２ 多态性引物的筛选 先构建极端抗、感材料
东海洋大学蓖麻课题组提供的 ６６ 份自交系和杂 的 ＤＮＡ 混池ꎬ用于筛选多态性引物ꎮ 再用小群体
交种ꎻ二是来自 １１ 个国家 １５ 个地区的 ６５ 份自交 抗、感个体验证筛选出的多态性引物ꎬ并对非多态
系、杂交种和少量野生材料ꎻ三是 １２１ 份中国华南 性引物进行再次筛选ꎬ以防多态性引物的遗漏ꎮ
野生材料ꎮ １.５.３ ＰＣＲ 扩增及产物鉴定 使用 １０ μＬ 的反应
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１.１. ２ 供 试 菌 株 供 试 菌 株 为 茄 腐 镰 孢 菌 体系ꎬ包括模板 １ μＬ(３０ ｎｇμＬ )、引物 １ μＬ(１０
(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ)ꎬ由广东海洋大学滨海农业学院 μｍｏｌ Ｌ )、 ２ × Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ４ μＬ ( １０ ×
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植物病理研究室分离、保存和提供ꎮ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、２５ ｍｍｏｌＬ ＭｇＣｌ １.６ μＬ、５ ＵμＬ
２
１.２ 材料的种植 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０.２ μＬ、１０ ｍｍｏｌＬ ｄＮＴＰｓ ０.２
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用 ２.５％的次氯酸钠溶液浸泡种子 １０ ｍｉｎꎬ经 μＬ)、ｄｄＨ Ｏ ４ μＬꎮ 扩增程序:９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ
２
自来水清洗后ꎬ用 ５０ ℃ 温水浸种 ３０ ｍｉｎꎬ洗净后 ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５５ ℃ 复性 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ４５ ｓꎬ共
播种于盛有灭菌营养基质的育苗盘ꎬ每穴播 １ 粒 ３５ 个循环ꎻ７２ ℃ 终延伸 ７ ｍｉｎꎻ４ ℃ 保存ꎮ ＰＣＲ 扩
种子ꎮ 当幼苗四叶一心时ꎬ进行人工接种ꎮ 在接 增在 Ｂｉｏｒａｄ(Ｍｙ Ｃｙｃｌｅｒ)型 ＰＣＲ 仪进行ꎮ 扩增产物
种后第 ４ 天ꎬ选择规格一致的幼苗移栽到花盆中ꎬ 用 ６％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离ꎬ２２０ Ｖ 恒压电
每盆 ５ 棵ꎬ每个材料 ３ 盆ꎮ 泳分离 ２.５ ｈꎮ 银染、水洗、显影后读带ꎮ
１.３ 孢子悬浮液的制备及接种方法 １.５.４ 基因型数据的读取 采用 ０、１ 数据记录电泳
将试管保存的茄腐镰孢菌转接到 ＰＤＡ 培养基 分离 结 果ꎬ 在 相 同 位 置 上ꎬ 有 带 记 为 １ꎬ 无 带 记
上培养 ７ ｄꎬ打取直径 ０.５ ｃｍ 的菌饼ꎬ接种到 ＰＤＡ 为 ０ꎮ
培养基中扩繁ꎻ７ ｄ 后加入无菌水ꎬ刮取表面菌丝ꎬ １.５.５ 相关回归分析 参照单标记定位原理(翟虎渠
４ 层纱布过滤后ꎬ用血球计数板在光学显微镜下计 和王健康ꎬ２００７)ꎬ对 ２５２ 份材料作抗性和分子标记
算分生孢子的数量ꎬ用无菌水将孢子浓度调至 １× 间的回归分析ꎬ若回归关系显著ꎬ则为抗病分子标
１０ 个ｍＬ ꎮ 四叶一心时ꎬ采用灌根法接种ꎬ即在 记ꎮ 用 ＳＰＳＳ ２６.０ 统计分析软件处理相关数据ꎮ
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每株幼苗根际周围的基质中注射 １５ ｍＬ 孢子悬浮
液ꎮ 接种后的材料置于温室内培养ꎬ温度 ２０ ~ ２８ ２ 结果与分析
℃ 、相对湿度 ７０％ ~ ８０％ꎬ自然光照明ꎮ
１.４ 抗病性鉴定 ２.１ 菌株的培养和孢子悬浮液的制备
采用接种后的枯萎天数和发病率作为评价指 培养基上菌株长势良好( 图 １:ＡꎬＢ)ꎬ光学显
标ꎬ只要有枯萎就算发病ꎮ 接种后ꎬ每天调查不同 微镜下分生孢子形态正常( 图 １:Ｃ)ꎮ 经镜检ꎬ孢
材料的发病时间、发病株数并计算发病率和抗病 子浓度为 １×１０ 个ｍＬ ꎮ
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材料比率ꎬ直至无新的发病株出现( 本试验为 ６０ ２.２ 抗病性鉴定
ｄ)ꎬ才停止调查ꎮ 不同材料的发病率存在明显差异( 表 １)ꎮ 最
抗性评价标准:１ 级( 高抗)ꎬ６０ ｄ 以上ꎻ２ 级 低的 为 ０ꎬ 有 １０５ 份 材 料ꎬ 均 为 高 抗ꎻ 最 高 的 为
(中抗)ꎬ４６ ~ ６０ ｄꎻ３ 级 ３１ ~ ４５ ｄꎻ４ 级 １６ ~ ３０ ｄꎻ５ １００％ꎬ有 ５ 份材料ꎬ发病最快ꎬ均为高感ꎬ表明发病
级 １ ~ １５ ｄꎮ 条件充分、抗性鉴定结果可靠(图 ２)ꎮ