Page 169 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期 韩霜等: 藏茵陈基源植物皱边喉毛花的全长转录组信息分析 １ ３ ３ ７
据库比对ꎬ筛选药用相关成分合成相关的代谢通 行校正ꎬ生成校正序列( ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ)ꎮ 利
路和转录本ꎮ 全长转录组能够为皱边喉毛花药用 用 ＣＤ￣ＨＩＴ 软件( Ｆｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１２) 对校正后的转录
成分合成相关的关键基因的筛选提供重要的遗传 本进行冗余分析ꎮ
资源ꎮ １.２.３ 全长转录组序列分析 对去冗余后的序列进
行基因功能注释ꎬ所使用的数据库包括非冗余蛋白
１ 材料与方法 数据库(Ｎｏｎ￣Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａｂａｓｅꎬＮＲꎬ Ｄｅｎｇ
ｅｔ ａｌ.ꎬ２００６)、蛋白质家族域数据库(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ
１.１ 试验材料 ＤａｔａｂａｓｅꎬＰｆａｍꎬ Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１４)、蛋白质真核同源
新鲜幼叶采集于海南藏族自治州共和县(地理 数据库(Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ＧｒｏｕｐｓꎬＫＯＧꎬ Ｋｏｏｎｉｎ
坐标为 １００°５３′５８. ４４″ Ｅ、３６° ２２′１９. ００″ Ｎꎬ海拔为 ｅｔ ａｌ.ꎬ２００４)、 蛋 白 质 原 核 同 源 数 据 库 ( Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ
３ ５１８ ｍ)ꎬ采集后迅速置于液氮罐中保存ꎬ后将其转 Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＰｒｏｔｅｉｎｓꎬＣＯＧꎬＴａｔｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ.ꎬ
移至－８０ ℃ 的超低温冰箱中ꎬ用于后续 ＲＮＡ 提取ꎮ ２００３)、 东 京 基 因 与 基 金 组 百 科 全 书 ( Ｋｙｏｔｏ
凭证标本(Ｚｈａｎｇ２０１８０２６) 存放于中国科学院西北 Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ＧｅｎｏｍｅｓꎬＫＥＧＧꎬＭｉｎｏｒｕ ｅｔ
高原生物研究所青藏高原生物标本馆(ＨＮＷＰ)ꎮ ａｌ.ꎬ２００４)、基因本体论数据库(Ｇｅｎｅ ＯｎｔｏｌｏｇｙꎬＧＯꎬ
１.２ 方法 Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０００)、核酸序列数据库(Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
１.２. １ ＲＮＡ 提 取 和 文 库 构 建 采 用 Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅꎬ ＮＴ ) 和 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ 数 据 库 ( ａ
Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ( Ｔｒｉｚｏｌ) 试剂法( Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００６) 提 ｍａｎｕａｌｌｙ ａｎｎｏｔａｔｅｄ ａｎｄ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
取皱边 喉 毛 花 的 总 ＲＮＡꎬ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ｄａｔａｂａｓｅ)等ꎬ以此获得更全面的基因功能信息ꎮ
ＲＮＡ 降解程度及污染情况ꎬ并评估其质量和完整 １.２.４ 全长转录组结构分析 利用 ｉＴＡＫ ｖ １.７ａ 软
性ꎮ 检测合格的 ＲＮＡ 样品用于构建皱边喉毛花 件(参数设置:－ｆ ３Ｆ) 对皱边喉毛花进行转录因子
全长转录组测序文库ꎮ 具体操作如下:在反转录 (ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎬＴＦ)预测( Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１６)ꎮ
酶的作用下ꎬ以 Ｏｌｉｇｏ ＤＴ 为引物、目标 ｍＲＮＡ 为模 利用 ＭＩＳＡ( ＭＩｃｒｏＳＡｔｅｌｌｉｔｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ) ｖ １.０
板ꎬ进 行 反 转 录ꎬ 通 过 低 循 环 ＰＣＲ 扩 增 全 长 软件 检 测 简 单 重 复 序 列 标 记 ( ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｃＤＮＡꎬ利用 ＮＥＢＮｅｘｔ Ｅｎｄ ｒｅｐａｉｒ / ｄＡ￣ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ ｒｅｐｅａｔｓꎬＳＳＲ)ꎬ设 置 单 核 苷 酸、 二 核 苷 酸、 三 核 苷
末端修读及加 ｐｏｌｙ( Ａ) 尾ꎬＯＮＴ ＳＱＫＬＳＫ１０９ 试剂 酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的最少重复次
盒及 ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ 用于测序接 数分别为 １０、 ６、 ５、 ５、 ５、 ５ꎬ其余参数默认(Ｂｅｉｅｒ ｅｔ
头的连接ꎮ 建好的文库采用 ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ( Ｏｘｆｏｒｄ ａｌ.ꎬ ２０１７ )ꎮ 利 用 ＣＮＣＩ ｖ ２ ( Ｃｏｄｉｎｇ￣Ｎｏｎ￣Ｃｏｄｉｎｇ
Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 公司ꎬ英国) 测序平台 进 行 ＩｎｄｅｘꎬＳｕｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)、 ｐｌｅｋ ｖ １. ２ ( Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ
测序ꎮ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ａｎｄ ｍＲＮＡｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｋ￣ｍｅｒ
１.２.２ 数据处理 测序完成后对原始数据进行过 Ｓｃｈｅｍｅꎬ Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４ )、 ＣＰＣ２ ｖ ０. １ ( Ｃｏｄｉｎｇ
滤ꎬ 去 除 接 头 以 及 低 质 量 的 ｒｅａｄｓꎮ 采 用 软 件 Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ ２ꎬＫａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１７) 软件以及
ＳＭＲＴｌｉｎｋ ｖ８. ０ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｐａｃｂ. ｃｏｍ / ｓｕｐｐｏｒｔ/ Ｐｆａｍ 数据库(Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１４)对 ＰａｃＢｉｏ 测序数据
ｓｏｆｔｗａｒｅ￣ｄｏｗｎｌｏａｄｓ)进行过滤和处理ꎮ 参数设置: 进行编码潜能预测( 参数设为默认)ꎬ获得的长非
－ｍｉｎＬｅｎｇｔｈ ５０( 最 小 长 度 为 ５０ ｂｐ)ꎬ － ｍａｘＬｅｎｇｔｈ 编码 ＲＮＡ( ｌｏｎｇ ｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡꎬＬｎｃＲＮＡ) 用于后
１５ ０００(最大长度为 １５ ０００ ｂｐ)ꎬ－ｍｉｎＰａｓｓｅｓ １( 最 续分析ꎮ
小的 ｆｕｌｌｐａｓｓ 数为 １)ꎮ 利用 ｓｕｂｒｅａｄ.ｂａｍ 文件得到
环 形 一 致 性 序 列 ( ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ２ 结果与分析
ＣＣＳ)ꎬ对其进行分类ꎬ搜寻并聚类 ＦＬＮＣ 序列ꎬ得
到 ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ 序 列ꎮ 利 用 Ａｒｒｏｗ 软 件 对 得 到 的 ２.１ 全长转录组测序及组装
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ 序列进行校正ꎬ获得高质量的全长优化 经 ＳＭＲＴ ( Ｓｉｎｇｌｅ￣Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ￣Ｔｉｍｅ) 测序共
序列(ｐｏｌｉｓｈｅｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ)用于后续分析ꎬ最终统计 获 得 １７ Ｇｂ 的 原 始 数 据ꎮ 对 其 过 滤 后 获 得
得 到 有 效 数 据ꎮ 为 提 高 数 据 的 准 确 性ꎬ 利 用 １７ ３１５ ０６６ 个 ｓｕｂｒｅａｄｓꎮ 基于 ｓｕｂｒｅａｄ.ｂａｍ 文件获
ＬｏＲＤＥＣ 软件(Ｓａｌｍｅｌａ ＆ Ｒｉｖａｌｓꎬ２０１４)对转录本进 得７９５ ６９８ 个 ＣＣＳ 序列ꎬＮ５０ 长度为 ２ １４３ ｂｐꎬ最
